荔枝体细胞胚胎发生及种质超低温保存研究

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荔枝(Litchi chinesis Sonn)属无患子科(Sapindaceae)荔枝属(LitchiSonn),是我国南方著名的一种亚热带果树。由于离体培养比较困难,使得荔枝体胚发生和种质离体保存研究进展缓慢。作者于2001年7月~2003年3月以荔枝为试验材料,对体胚发生和种质超低温保存进行了深入研究,旨在探索影响其体胚发生和种质超低温保存的因素,建立起较完善的体胚发生体系和胚性悬浮细胞的玻璃化法冻存体系,以期荔枝为生物技术应用和种质超低温保存提供理论基础和技术支持。 主要研究结果如下: 1 从外植体的选择,愈伤组织的诱导,胚性愈伤组织的建立,体胚诱导,体胚生长发育以及植株再生等方面对荔枝花药体胚发生进行了系统研究。结果表明花药在MS+2,4-D 2mg/L+NAA 0.2mg/L以及含50g/L蔗糖的培养基上诱导胚性愈伤组织的效果好,把胚性愈伤组织先后转移到分化培养基MS+KT 0.5mg/L+NAA0.1mg/L,活性炭0.5%;成熟培养基MS+BA 1mg/L+KT 1mg/L+NAA0.5mg/L,水解酪蛋白500mg/L,蔗糖50g/L几上培养2~3个月能再生植株。初步建立了以花药培养为基础的荔枝体胚发生系统。 2 对荔枝胚性愈伤组织保存进行初步研究,结果表明胚性愈伤组织适宜在MS+2,4-9 1mg/L+NAA 0.2mg/L培养基中进行保存,并通过固体与液体交替培养方式可以达到长期保存胚性愈伤组织的目的。本研究已对胚性愈伤组织保存一年,至今仍具有良好的生长势和胚性特征。 3 首次采用玻璃化法对荔枝胚性悬浮细胞进行超低温保存。适宜的保存程序为:取换液后3~5d的胚性悬浮细胞→0.4mol/L山梨醇预培养2d→室温下60%PVS2预处理15min→0℃下PVS2处理15~20min→迅速投入液氮→40℃水浴快速化冻→1.2mol/L的蔗糖+MS基本培养基洗涤→TTC检测和恢复生长。TTC检测保存细胞的相对存活率高达27.1%。 4 应用透射电镜观察了胚性悬浮细胞在预培养、脱水、冷冻等玻璃化法冷冻的全过程中细胞超微结构的变化,研究发现有部分细胞结构完整;但也有部分细胞在处理过程中,质膜、核膜发生致死伤害。
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