腺病毒载体(Adenovirus Vector,AdV)作为基因治疗的运载系统近年来发展较快,在已经报道1000多种基因治疗的临床方案中,约26%是用腺病毒作为载体。AdV最大的优点就是可以在包装细胞内高滴度复制,另外,它是上呼吸道自然存在的温和病毒,宿主范围广,可以感染多种分裂期和非分裂期的细胞。各种基因重组腺病毒在抗肿瘤、瘢痕修复、治疗遗传病等方面的研究越来越被人们重视,基因重组的腺病毒产品在临床前及临床治疗的需求量已经越来越大。因此需要设计和建立一种高效且成本低廉的重组腺病毒生产工艺,生产出足量的符合临床标准的腺病毒基因药物产品。持续灌注悬浮培养HEK293细胞是目前生产腺病毒最常用的方法之一,通过不断更换培基,提供充足的营养成分且带走代谢产物,同时应用细胞截留装置使细胞保留于生物反应器内,优化了细胞培养环境,从而可达到较高的细胞密度,该技术自60年代末发展至今已成为哺乳动物细胞大规模培养的主要方法之一。我们对灌注培养HEK293细胞生产携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)、携带肝细胞生长因子基因的腺病毒载体(Ad-HGF)以及携带p53,GM-CSF和B7-1基因的腺病毒载体(BB-102)进行了实验研究。结果表明,灌注率为1.5～2vol/d比较合适;感染腺病毒后48小时是收获细胞的最佳时机,细胞密度在3.0×10~6/ml左右感染病毒时单细胞病毒和单位体积病毒产量均较高。通过上述实验我们初步建立起了利用5L生物反应器悬浮培养293 N3S细胞生产重组腺病毒的生产工艺,可以获得较大量高滴度的重组腺病毒。两步氯化铯密度梯度超速离心法是重组腺病毒纯化的传统方法,也是生产小量临床级产品的有效方法,我们应用此方法来生产能够满足临床试验要求的重组腺病毒药物。并且根据制造工艺和《中国生物制品规程》规定的标准,对氯化铯密度梯度离心法获得的重组腺病毒产品进行了以下质量检测:物理检查、无菌试验、病毒活性检定、病毒纯度测定、复制型腺病毒检定、细菌内毒素检测、残留物检测和腺病毒特征基因鉴别试验,产品各项检测基本合格。氯化铯密度梯度超速离心法虽然是生产临床级重组腺病毒产品的有效方法,但是此法不能放大,不适合工业化生产。近年来应用阴离子交换树脂已经逐渐成为了主要分离纯化手段并取得了较好的结果。我们应用Q Sepharose XL阴离子交换色谱法对含有重组腺病毒Ad-GFP的细胞裂解液进行分离纯化。实验结果显示,经Q Sepharose XL分离纯化可以有效去除细胞裂解液中的核酸和杂蛋白,最终的腺病毒回收率在71%左右。产品经A260/A280比值,HPLC检测及SDS-PAGE分析,与氯化铯密度梯度离心法获得的腺病毒产品纯度相似。此方法省时省力,可以进行灵活放大,适合于商业化生产。