治疗性克隆(therapeutic cloning)是体细胞核移植技术与人胚胎干细胞技术相结合的产物。它是指以患者的体细胞作为供体，移入去核的卵母细胞内，将异构胚培育至囊胚并从内细胞团中分离培养出胚胎干细胞，从而为患者提供与其自身遗传物质一致的组织细胞或器官，用于患者疾病的治疗。目前“治疗性克隆”已经成为研究热点，但由于人类卵母细胞来源非常有限且受到法律伦理等多种因素的限制，很难获得足够数量的人卵母细胞用于实验研究。异种核移植技术的出现则为解决这一难题提供了可能。本实验目的在于探讨牛成熟卵母细胞能否支持人胎儿成纤维细胞核重编程，使异构胚在体外完成其早期发育，并进一步优化异种核移植过程的融合条件、发育条件等各个环节。 一、人胎儿成纤维细胞的体外培养 1．通过绘制第六代人胎儿成纤维细胞生长曲线，研究了人胎儿成纤维细胞的增殖规律。结果表明：人胎儿成纤维细胞生长旺盛，生长增殖的滞留期为1-2天，对数生长期为3-6天，平台期为7-8天。 2．以DMSO为冷冻保护剂，采用手工冷冻的方法对人胎儿成纤维细胞进行冷冻保存。结果表明：人胎儿成纤维细胞可用该方法冷藏。 3．通过染色体核型分析，研究人胎儿成纤维细胞体外培养传至第10代时的状态。结果表明：人胎儿成纤维细胞体外培养传至第10代时，染色体为正常二倍体的细胞比例为75％，未见细胞内颗粒增多、折光性差等细胞老化现象。 4．以血清饥饿培养法和常规培养法处理第八代和第二十代人胎儿成纤维细胞后，通过流式细胞仪分析细胞所处的周期。结果表明：血清饥饿培养法和常规培养法均可使不同代次的人胎儿成纤维细胞同步于G<,0>/G<,1>期，但第二十代细胞经饥饿培养后，G<,0>/G<,1>期细胞的百分比显著高于其他三组。 二、人-牛异种核移植构建异构胚 1．异种核移植实验表明：牛成熟卵母细胞可以支持人胎儿成纤维细胞核完成重编程，异构胚可以在体外完成其早期发育。 2．以处于不同细胞周期的不同代数的人成纤维细胞为供体进行人-牛异种核移植，比较不同细胞周期的不同代数的供体细胞对核移植融合率、发育率和囊胚率的影响。结果表明：经饥饿处理与未经饥饿处理的供体细胞均可支持异构胚完成早期发育，但饥饿处理对于低代次细胞来说可能是非必要因素，但对于高代次细胞则是提高核移植效率的必要步骤，饥饿处理可使核移植融合率和发育率显著的提高。 3．比较了以4℃冷藏和直接消化为供体细胞的准备方法时，异构胚的体外发育情况。结果表明：两种方式都可用于核移植，且两组之间无显著差异。因此，冷藏可作为一种简便有效的供体细胞准备方法。 4．比较了电压为160V/mm、脉冲间隔1s，电压为180V/mm、脉冲间隔1s和电压为200V/mm、脉冲间隔0.1s三组融合参数，通过融合率、卵裂率和异构胚的死亡率选择效果最好的一组参数。结果表明：当融合参数为200V/mm，脉冲时长100μs，脉冲间隔0.1s时，异构胚的融合效果最好，融合率为61.90％。 5．比较了采用商品化的人胚胎发育液Queen’s和传统的牛胚胎发育液SOFaa培养异构胚时，异构胚的体外发育情况。结果表明：二者均可支持异构胚完成体外早期发育，且卵裂率、桑囊发育率上差异不显著。 6．通过胚胎染色体的数目及形态初步确定了人-牛异种异构胚的核遗传物质来源于人。