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植物细胞培养是一种最有希望解决紧缺次生代谢物来源的方法,然而植物细胞培养生产次生代谢产物如紫杉醇的产量较低。紫杉醇是来源于红豆杉的具有广谱抗肿瘤作用的二萜类生物碱,当前市场需求大,药物来源紧张。红豆杉细胞培养生产紫杉醇是解决其供需矛盾的有效方法之一。然而,利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇同样存在着产量较低,工业化成本较高的问题。转录因子可激活特定次生代谢产物系列合成酶的协同表达,有效地促进目标次生代谢产物的合成。因而利用转录因子构建转基因细胞系成为解决此问题的有效途径之一。本论文通过研究MeJA和SA诱导紫杉醇合成酶基因的表达模式,选择显著受到MeJA和SA诱导的紫杉醇合成酶基因作为研究对象,分别克隆其启动子并鉴定其关键的顺式作用区,采用酵母单杂交技术筛选转录因子,并通过过表达和RNAi进行转录因子的功能研究,筛选调控紫杉醇合成的转录因子,同时构建受微量酒精诱导转录因子表达的中国红豆杉转基因细胞系,实现调控紫杉醇合成的转录因子的可控表达和紫杉醇稳定可控合成。本研究取得创新性结果如下:(1)获得MeJA和SA诱导紫杉醇合成酶基因的表达模式,发现MeJA对于紫杉醇合成的前期步骤基因如ts、t5αh、tat诱导非常显著,而SA则显著诱导紫杉醇合成中后期步骤t13αh,tbt,dbat,dbtnbt,bapt。(2)获得了紫杉醇合成酶基因ts、dbat的启动子序列。用PLACE和PlantCARE对分离的启动子序列进行分析发现,ts启动子中含有典型的JA响应元件,包括G-box、TGACG等,而在dbat启动子上则含有典型的SA响应元件如W-box等。采用农杆菌和基因枪分别转化烟草和红豆杉细胞,经GUS分析发现ts、dbat基因启动子均能驱动GUS基因在烟草和红豆杉细胞中表达,且ts启动子的(-239/-131)为JA响应区,dbat启动子的(-940/-240)为SA响应区。(3)以获得的ts启动子JA响应区和dbat启动子SA响应区为为诱饵,采用酵母单杂交技术筛选获得一个可以和ts启动子JA响应区结合的bHLB家族类转录因子TcMYC蛋白,以及一个可与dbat启动子SA响应区结合的WRKY家族类转录因子TcWRKY1,亚细胞定位实验证明其均定位于细胞核,且EMSA分析发现TcWRKY1可在体外结合dbat启动子SA响应区上的2个W-box。对TcWRKY1在中国红豆杉细胞中进行过表达和RNAi分析发现TcWRKY1能激活dbat基因的表达,而TcMYC的过表达则可激活ts基因的表达。(4)构建微量酒精诱导转录因子TcWRKY1表达载体,以获得的转录因子TcWRKY1为目标基因,将其构建到微量酒精诱导载体上转化到中国红豆杉细胞中,酒精诱导后发现ts,t5αh,dbbt,dbat,dbtnbt基因的表达增强,且紫杉醇含量提高了2.7倍。