论文部分内容阅读
Bcl-2家族蛋白中具有抗凋亡作用的Bcl-2-like蛋白,是恶性肿瘤逃脱凋亡、获得永生的关键分子。Bcl-2家族蛋白之间的相互作用界面：BH3沟槽,是小分子抗癌药的重要靶点。研究发现,占据Bcl-2和Mcl-1两个蛋白的BH3沟槽的小分子,能够特异地拮抗Bcl-2-like蛋白的抗凋亡功能,发挥高效、广谱、高特异的抗肿瘤的作用。这类分子被称为小分子BH3模拟物(BH3mimetics)本研究以一个非DNA靶向的肿瘤细胞凋亡诱导剂S1(3-硫吗啉-8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈)为研究对象,通过蛋白检测、细胞生物学、结构生物学、构效关系研究和动物实验等多种方法,证明了一个全新结构、亚微摩尔级(sub-μM)的BH3模拟物。进一步地,证明了S1的抗肿瘤分子药理学机制,是通过竞争结合这两个蛋白的BH3结构域,发挥完全依赖Bax/Bak的凋亡诱导和体内抗肿瘤作用。它是一个兼具高特异性和Bcl-2/Mcl-1双靶向性的BH3模拟物。荧光偏振(FP)实验和ITC实验证明：S1能够以sub-μM级亲和力竞争天然BH3肽段,直接结合Bcl-2(Ki=310nM)和Mcl-1(Ki=58nM)蛋白。免疫共沉淀、FRET等细胞生物学实验证明了S1在多种肿瘤细胞系(人乳腺癌细胞系MCF-7、人宫颈癌细胞系Hela、人肝癌细胞系SMMC-7721、人结肠癌细胞系HCT116和人白血病细胞系K562)中,以剂量和时间依赖的方式解离Bcl-2/Bax、 Bcl-2/Bim和Mcl-1/Bak二聚体,诱导完全依赖Bax/Bak的细胞色素c的释放和caspase激活,最终导致细胞凋亡。这一分子机制同样决定了S1在H22肝癌小鼠移植模型体内的凋亡诱导作用。蛋白质二维核磁结果进一步证明S1结合于Mcl-1蛋白的BH3沟槽。利用S1,通过基于片段(Fragment-based)的药物研究方法,研究证明了S1发挥凋亡诱导作用的分子结构基础在于： S1的羰基与Mcl-1蛋白的R263残基形成的氢键,是其占据BH3沟槽的主要分子间力。同时还首次揭示了Mcl-1蛋白的一个重要的结构信息：R263残基可能是Mcl-1BH3沟槽的最重要的位点(hot spot),对小分子配基的结合起到至关重要的作用。以S1作为研究工具,利用S1对Bcl-2家族网络两个重要节点蛋白Bcl-2和Mcl-1的双靶向性,首次揭示了在Bcl-2家族网络中,Mcl-1蛋白动态调节的分子机制。通过实时检测多个时空点的多个蛋白和多种蛋白复合物的成分和功能的动态变化,证实：Bim能够在Bcl-2和Mcl-1之间穿梭,结果导致Mcl-1水平上调,抗凋亡功能增强。在该机制作用下,S1诱导的凋亡被阻滞。直到Bak被S1从Mcl-1的BH3沟槽中释放,平衡才开始向凋亡倾斜,激活了caspase3,切割Mcl-1,通过下调Mcl-1水平进一步增强Bak的释放,从而促进凋亡进行。这个由S1揭示的Bcl-2家族网络的交叉对话机制补充了对Bcl-2家族药靶网络的认识,为BH3模拟物的分子药理机制提供了重要的理论依据。在S1进入临床前研究的同时,本论文开展了S1的分子标志物的研究。明确Bak可能是S1抗肿瘤的预测分子标志物。ShRNA实验证明S1诱导的凋亡依赖Bak而不是Bax；先天缺失Bak的胃癌细胞系MKN-28对S1耐药,而先天缺失Bax的前列腺癌DU145细胞对S1敏感。通过多种肿瘤细胞系和H22肝癌小鼠移植模型研究,Mcl-1的下调被确定可能作为S1抗肿瘤的疗效监控分子标志物。这将为未来S1的临床试验的分组设置、以及个性化治疗提供理论依据。