人脑胶质瘤是成人最为常见的中枢神经系统原发性肿瘤,每年新发的恶性原发脑肿瘤中70%为恶性脑胶质瘤。尽管相对于其他部位肿瘤较少见,但恶性脑胶质瘤却有着与之不成比例的非常高的致残率和死亡率。虽然应用于脑胶质瘤治疗的手术、放疗、化疗等多学科的综合治疗措施不断改进,但近五十年来恶性脑胶质瘤总的预后改善甚微。尤其是占恶性胶质瘤60-70%的胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM),其中位生存期仅12-15个月。复发性恶性脑胶质瘤预后就更差,仅有3-9个月。一般认为肿瘤的促血管生成作用和侵袭性是其难根除、易复发的根本原因。恶性胶质瘤呈浸润性生长,肿瘤细胞易侵入周围正常脑组织而难以彻底切除；残留胶质瘤细胞通过诱导肿瘤周围微环境中血管新生而复发形成新的实体瘤灶。抗血管生成药物用于脑胶质瘤治疗一度取得明显效果,但恶性胶质瘤最终还是产生了耐药性。主要原因就在于血管生成受抑制本身又诱导了恶性胶质瘤细胞的侵袭性得以增强。因此,对恶性胶质瘤侵袭性调控因素与机制的深入研究就更加重要。白细胞介素6(Interleukin-6, IL-6)是一种重要的多功能细胞因子,参与调节造血、免疫与炎症反应,与细胞生存、凋亡、增殖等密切相关,也参与调节中枢神经和心血管系统的重要生理功能。同时IL-6在多发骨髓瘤、淋巴瘤、前列腺癌、脑胶质瘤等多种肿瘤中均有高表达,且与肿瘤预后呈正相关。最近一些研究表明,IL-6能直接影响结直肠癌和头颈部肿瘤的侵袭性。在恶性脑胶质瘤,IL-6自分泌现象从1990年就已发现,而且其异常分泌也与恶性胶质瘤的形成、血管新生、病理分级、预后均密切相关。然而,IL-6在胶质瘤的恶性进展中作用机制究竟如何尚不清楚,IL-6对人脑胶质瘤侵袭性的影响如何未见研究报告。IL-6的多种功能由其广泛分布的细胞受体(gp80／gp130异源二聚体)介导,其中gp80(即IL-6R,α链)为IL-6结合部,gp130(p链)则为IL-6家族细胞因子受体通用的信号转导亚单位。IL-6通过其受体传导激活JAK/STAT3信号通路,形成STAT3(信号传导和转录活化因子3,Signal Transducers and Activators of Transcription 3)二聚体继而转座入核调节其靶基因转录活性。STAT3是细胞信号传导通路JAK/STAT3途径的关键转录因子,调控下游cyclinD1、survivin、VEGF等多种基因的转录激活。异常的STAT3信号通路参与了包括胶质瘤在内的多种肿瘤的恶性转化和增殖,通过上调多种致癌基因的表达,抑制肿瘤细胞的凋亡,促进肿瘤细胞的增殖,最终导致恶性肿瘤的发生和发展。因而STAT3也被视为一种重要的转录因子类癌基因。IL-6能在正常和肿瘤细胞中诱导基质金属蛋白酶(MMPs, matrix metalloproteinases)的表达。在黑色素瘤,磷酸化STAT3通过直接结合其启动子进而调节MMP-2分泌。那么,在胶质瘤细胞,IL-6是否也可能通过JAK/STAT3信号通路调节MMPs分泌来影响人脑胶质瘤细胞侵袭性自然引起人们的关注。Fascin-1(集束蛋白)是一种分子量为55kDa的actin结合蛋白,在多种恶性肿瘤中与细胞运动密切相关。在恶性胶质瘤,fascin-1蛋白的异常高表达已被证明与病理分级、预后、迁移与侵袭性相关。体外实验中通过RNA干扰(RNAi, RNA interference)技术抑制fascin-1表达发现恶性胶质瘤细胞的侵袭性也随之被抑制。IL-6对恶性胶质瘤细胞侵袭性的影响是否也有fascin-1蛋白参与,是否也通过JAK/STAT3信号通路调节成为本研究又一焦点。本课题旨在研究IL-6对人脑胶质瘤细胞侵袭性的影响及相关机制,藉此探讨胶质瘤抗侵袭治疗策略可能的新靶点。研究内容分为三个部分。一、IL-6对人脑胶质瘤细胞侵袭性影响的研究目的检测在IL-6作用下人脑胶质瘤细胞系侵袭性的变化情况。方法1、CCK-8比色法检测在在浓度梯度IL-6作用下人脑胶质瘤细胞系U87 MG和U251细胞的增殖效应。2、损伤修复实验检测在浓度梯度IL-6作用下人脑胶质瘤细胞系U87 MG、U251和U343在指定时间内细胞层划痕修复速度的差异。3、Transwell侵袭实验检测在浓度梯度IL-6作用下人脑胶质瘤细胞系U87MG、U251、U343在指定时间内穿越Matrigel基质胶及滤膜的细胞数量的差异。结果1、人脑胶质瘤细胞系U87 MG和U251在0-100ng/ml IL-6作用下,各浓度组24小时与12小时细胞增殖率无显著性差异(P>0.05)。2、人脑胶质瘤细胞系U87 MG和U251分别在浓度梯度IL-6作用9小时和12小时后细胞层划痕修复速度呈现显著性差异(P<0.05),且呈浓度依赖趋势。但U343细胞各浓度组无显著性差异(P>0.05)。3、人脑胶质瘤细胞系U87 MG和U251在浓度梯度IL-6作用16小时后细胞穿越Matrigel基质胶及滤膜的数量有显著性差异(P<0.05),且呈浓度依赖趋势。但U343细胞各浓度组无显著性差异(P>0.05)。结论1、IL-6对人脑胶质瘤细胞迁移速度有促进作用,且呈浓度依赖趋势,但有细胞株差异性。2、IL-6对人脑胶质瘤细胞侵袭性有促进作用,且呈浓度依赖趋势,但有细胞株差异性。二、IL-6与STAT3信号通路对人脑胶质瘤细胞MMP-2分泌调节的研究目的研究IL-6对人脑胶质瘤细胞JAK/STAT3信号通路的激活作用、IL-6对人脑胶质瘤细胞分泌MMP-2的影响、JSI-124阻断IL-6激活STAT3信号通路及小干扰RNA(siRNA)沉默STAT3基因表达后人脑胶质瘤上清中细胞MMP-2活性的变化及侵袭性的变化。方法1、RT-PCR方法检测分析人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用9小时后MMP-2基因mRNA表达水平的差异。2、Western印迹法检测分析人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用16小时后上清中MMP-2分泌量的差异。3、应用明胶酶谱法分析人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用16小时后上清中分泌MMP-2活性的差异。4、Western印迹法检测分析人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用16小时后STAT3及其磷酸化活化蛋白的表达。5、Western印迹法检测分析人脑胶质瘤细胞系U87 MG在100ng／ml的IL-6和浓度梯度JSI-124共同作用16小时后STAT3及其磷酸化活化蛋白的表达,以验证应用JSI-124靶向性阻断STAT3信号通路的效果。6、应用明胶酶谱法分析人脑胶质瘤细胞系U87 MG在100ng/ml IL-6和浓度梯度JSI-124共同作用16小时后上清中MMP-2活性的差异。7、Transwell侵袭实验方法检测人脑胶质瘤细胞系U87 MG在100ng/ml IL-6和浓度梯度JSI-124共同作用16小时后穿越Matrigel基质胶及滤膜的细胞数量的差异。8、Western印迹法检测分析人脑胶质瘤细胞系U87 MG在转染siRNA24小时后总STAT3蛋白的表达,以验证应用siRNA沉默STAT3基因表达的效果。9、Transwell侵袭实验方法检测人脑胶质瘤细胞系U87 MG在转染siRNA 24小时后,再以100ng/ml IL-6刺激16小时穿越Matrigel基质胶及滤膜的细胞数量的变化。结果1、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用9小时后MMP-2基因mRNA表达水平显著增高(P<0.05),且呈浓度依赖性。2、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用16小时后上清中MMP-2分泌量显著增加(P<0.05),且呈浓度依赖性。3、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用16小时后上清中MMP-2活性显著增高(P<0.05),且呈浓度依赖性。4、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用16小时后STAT3信号通路激活仍保持浓度依赖性(P<0.05)。5、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在100ng/ml IL-6和浓度梯度JSI-124共同作用16小时后STAT3及其磷酸化蛋白的表达受到显著抑制(P<0.05),且对JSI-124呈浓度依赖模式。6、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在100ng/ml IL-6和梯度浓度JSI-124共同作用16小时后上清中分泌MMP-2活性受到SI-124显著抑制(P<0.05),且对JSI-124呈浓度依赖模式。7、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在100ng/ml IL-6和浓度梯度JSI-124共同作用16小时后细胞穿越Matrigel基质胶及滤膜的数量有显著减少(P<0.05),且对JSI-124呈浓度依赖趋势。8、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在转染siRNA 24小时后总STAT3蛋白的表达显著下降(P<0.05)。9、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在转染siRNA 24小时后,再以100ng/ml IL-6刺激16小时穿越Matrigel基质胶及滤膜的细胞数量显著减少(P<0.05)。结论1、IL-6能够持续激活人脑胶质瘤细胞U87 MG的STAT3信号通路；并能促进人脑胶质瘤细胞表达分泌活性MMP-2,均呈浓度依赖模式。2、JSI-124能够有效阻断人脑胶质瘤细胞U87 MG被IL-6激活的STAT3信号通路,并能抑制细胞MMP-2的分泌和Transwell侵袭力,三者均呈浓度依赖模式。3、特异性siRNA能够显著沉默人脑胶质瘤细胞U87 MG总STAT3蛋白的表达,也能明显抑制其Transwell侵袭力。4、IL-6通过激活人脑胶质瘤细胞U87 MG的STAT3信号通路调节MMP-2的分泌,可以认为是IL-6促进脑胶质瘤细胞侵袭性的分子机制。三、IL-6与STAT3信号通路对人脑胶质瘤细胞fascin-1表达调节的研究目的检测浓度梯度IL-6作用下人脑胶质瘤细胞运动相关蛋白fascin-1表达水平的变化、进而探讨浓度梯度JSI-124阻断STAT3信号通路后IL-6对人脑胶质瘤细胞fascin-1蛋白表达水平的影响。方法1、Western印迹法检测分析人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用15分钟后fascin-1蛋白表达水平的变化。2、Western印迹法检测分析人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用16小时后fascin-1蛋白表达水平的变化。3、Western印迹法检测分析人脑胶质瘤细胞系U87 MG在转染siRNA 24小时后,再以100ng/ml IL-6刺激15分钟后fascin-1蛋白表达水平的变化。4、Western印迹法检测分析人脑胶质瘤细胞系U87 MG在1OOng/ml IL-6和浓度梯度JSI-124共同作用16小时后fascin-1蛋白表达水平的变化。结果1、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用15分钟后fascin-1蛋白表达水平即显著增高(P<0.05),亦呈浓度依赖性。2、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在浓度梯度IL-6作用16小时后fascin-1蛋白表达水平各组均增高至较高水平,不再呈浓度依赖性(P>0.05)。3、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在转染STAT3 siRNA 24小时后,再以100ng/mlIL-6刺激15分钟fascin-1蛋白表达水平亦无显著变化(P>0.05)。4、人脑胶质瘤细胞系U87 MG在1OOng/ml IL-6和浓度梯度JSI-124共同作用16小时后各组fascin-1蛋白表达水平均增至较高水平,无浓度依赖趋势(P>0.05)。结论1、IL-6能够以浓度依赖模式迅速上调人脑胶质瘤细胞fascin-1蛋白表达水平。并且fascin-1在较快达到饱和水平后对外源性IL-6刺激不再反应。2、IL-6对人脑胶质瘤细胞fascin-1蛋白表达水平的上调并非经过STAT3信号通路实现。3、IL-6上调细胞运动相关的fascin-1蛋白表达水平应视为其促进人脑胶质瘤细胞侵袭性的另一作用机制。总之,通过本研究表明,IL-6能够通过激活STAT3信号通路调节MMP-2的分泌来促进人脑胶质瘤细胞侵袭性；同时还能通过非STAT3途径上调fascin-1蛋白表达水平来促进人脑胶质瘤细胞侵袭性。因而针对IL-6及其下游信号通路和蛋白分子靶点的恶性胶质瘤治疗策略前景值得期待。