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杂种优势利用作为提高作物产量的有效途径之一,已经被广泛应用于水稻、玉米、油菜等作物的杂交种选育中。大豆是粮油兼用作物,为天然闭花授粉作物,具有叶腋开花结荚的特点,随着大豆细胞质雄性不育/育性恢复（cytoplasmic male sterility/restorer-of-fertility,CMS/Rf）系统的成功研发,实现了杂种优势技术在大豆上的应用。目前生产实践中,大豆杂种优势利用多数都是通过“三系法”实现的。本项目针对前期初步定位的大豆细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）育性恢复基因Rf3候选区间较大,所含基因数量较多的问题,开展Rf3基因的精细定位,并对其进行初步鉴定,这不仅对开展大豆CMS/Rf互作机理的研究具有理论价值,也对新型恢复系的选育具有重要的实践意义。本研究利用大豆RN型CMS不育系JLCMS5A及恢复系JLR2作为亲本构建的F2分离群体所衍生的F3代育性分离群体为定位群体,对育性恢复Rf3基因进行精细定位,并对候选区间内的基因进行克隆及初步鉴定。得到的主要结论如下:（1）本团队前期将CMS恢复基因Rf3初步定位于大豆9号染色体分子标记d CPAS09-2和BARCSOYSSR＿09＿1178之间。本研究在此基础上,结合简单重复序列（simple sequence repeats,SSR）、插入缺失标记（insertion-deletion,In Del）、衍生的酶切扩增多态性（derived cleaved amplified polymorphic sequence,d CAPS）等分子标记构建恢复系JLR2中所含的育性恢复基因的遗传连锁图谱,将Rf3基因精细定位至9号染色体上分子标记d CAPs09-2与BARCSOYSSR＿09＿1170之间。构建育性恢复基因Rf3的物理图谱,以Williams82.a2.v1.作为参考基因组,Rf3基因所在物理区间大小为86.43 Kb,包含10个候选基因,即Glyma.09G171100-Glyma.09G172000。其中Glyma.09G171200编码五肽重复序列（pentatricopeptide repeat,PPR）,具有植物CMS育性恢复基因典型特征。（2）对候选区间内的10个基因进行克隆测序,经序列比对分析发现,候选区间内的Glyma.09G171200和Glyma.09G171800存在单核苷酸变异位点。其中Glyma.09G171200编码区（coding sequence,CDS）共有47处突变,包括38处非同义突变和9处同义突变。Glyma.09G171800共有2处突变,包括1处非同义突变和1处同义突变。（3）采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）技术对群体父母本的根、茎、叶、花苞、花等组织的Glyma.09G171200和Glyma.09G171800基因的表达水平进行鉴定。在恢复系JLR2的根、茎、叶、花苞、花中Glyma.09G171200基因表达水平显著高于不育系JLCMS5A,尤其是在茎、叶、花器官。推测JLR2所含的Glyma.09G171200特异编码orf为Rf3候选基因。（4）构建Rf3候选基因与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）融合的植物表达载体,对Glyma.09G171200基因进行亚细胞定位。通过观察发现,重组载体p CAMBIA1302:Rf3-GFP的荧光信号仅在在线粒体中出现,表明Rf3候选基因编码蛋白定位于线粒体,符合恢复基因特征。（5）利用Glyma.09G171200和Glyma.09G171800基因的SNP位点开发了两个与Rf3紧密连锁的酶切扩增多态性（cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS）分子标记CAPS1712和CAPS1718。利用CAPS1712结合限制性内切酶Sca I,可将父本切为897 bp、1204 bp两个片段,但无法切开母本材料;利用CAPS1718结合限制性Bsp EI,可将父本切为604 bp、1330 bp两个片段,同样无法切开母本材料。上述标记可用于Rf3基因型材料的分子标记辅助鉴定。