杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）为杜仲科杜仲属植物,是一种优质的中药材和产胶植物,在我国广泛分布,是我国特有的经济林树种。研究表明,杜仲中含有丰富的药用化合物,杜仲胶在绝缘性、耐受性、可塑性和柔韧性等方面有着优良的性能,是目前极具开发前景的优质天然橡胶资源之一。目前,在杜仲基因功能的研究中,通常需要对杜仲进行目的基因的遗传转化,以达到分析其基因功能的目的。但是,杜仲作为木本植物,其组织培养方法存在着转化周期较长、抗性植株生根困难、转基因植株移栽成活率较低等困难,导致杜仲这一类研究相对滞后。非组培遗传转化方法具有操作简单,成本低,用时短,能有效避免冗长繁琐的组织培养过程等优点,对杜仲基因功能研究具有重要意义。本研究利用石蜡切片技术确定最佳注射位点,采用农杆菌注射法对杜仲幼苗进行非组培遗传转化,探究不同菌液浓度对植株存活率的影响,经GUS组织化学染色、PCR鉴定、测序以及相对表达量测定等方法对转化植株进行鉴定,以期建立一种杜仲非组培遗传转化体系,取得如下研究结果:1杜仲幼苗最佳受创位点的确定本研究选取发芽后2-4天的杜仲幼苗,将去除两片子叶间第一片真叶后的杜仲幼苗作为转化材料,使用1m L医用注射器对杜仲幼苗茎尖部位进行注射处理,每个处理三次重复,每次重复处理100株杜仲幼苗,28℃黑暗培养3天后,将转化植株移于人工气候室（光周期16h/8h,光照强度3500lx,湿度70%）,正常管理植株。通过石蜡切片技术,以不做注射处理的杜仲幼苗作为对照,对杜仲幼苗茎尖石蜡切片纵切图进行观察。结果显示,注射部位的细胞分裂能力旺盛,适宜目的基因的导入和整合。因此,确定该区域为杜仲幼苗最佳注射位点。2不同菌液浓度对杜仲幼苗存活率的探究本研究通过设计8个菌液浓度梯度侵染杜仲幼苗,对转化15d后的杜仲幼苗进行存活率的统计和分析。结果显示,不同菌液浓度对杜仲幼苗存活率的影响不同,且差异显著。当OD600值为0.8时,存活率最高,为77.67%,;随着菌液浓度的升高,杜仲幼苗的存活率降低。当OD600值为1.8时,存活率最低,为53.00%;用SPSS软件对不同农杆菌浓度与植株存活率进行相关性分析,发现农杆菌浓度与植株存活率呈高度负相关,皮尔逊相关系数为-0.626,表明菌液浓度对杜仲幼苗存活率具有重要的影响作用。3不同菌液浓度对杜仲幼苗GUS阳性率的探究选取转化1个月的杜仲幼苗,从下往上数新长出的第三片新叶进行GUS组织化学染色,使用75%的乙醇进行脱色。结果显示,转化成功的杜仲植株叶片呈现蓝色。对GUS阳性率进行统计并分析。结果显示,当OD600值为1.8时,转化率最高,为11.00%,其次为0.8和2.0,分别为10.00%和9.67%;用SPSS软件对不同农杆菌浓度与植株GUS阳性率进行相关性分析,发现农杆菌浓度与植株GUS阳性率呈现负相关,皮尔逊相关系数为-0.128,表明菌液浓度对GUS阳性率的影响不显著。4杜仲转化植株PCR检测及测序鉴定对GUS染色呈阳性的杜仲转化植株分别进行GUS和35S-Eu SRPP3特异性引物PCR扩增,并用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示,野生型杜仲植株无扩增条带,部分杜仲转化植株有GUS（304bp）和35S-Eu SRPP3（768bp）特异性扩增条带,与质粒阳性对照目的条带相同。后对35S-Eu SRPP3特异性PCR产物胶回收后测序,根据转基因植株正反向测序结果与目的核苷酸序列进行比对分析,发现正反向测序结果与目的序列相似性为99%,进一步证明目的基因已经整合到杜仲基因组中。综合GUS组织化学染色和PCR检测,统计共获得11株正常存活的转基因杜仲植株,OD600值为0.8时,转化率最高,为3%。5目的基因相对表达量分析取经过PCR鉴定的转基因植株,提取RNA并反转合成c DNA,进行荧光定量PCR检测。结果显示,与对照相比较,转基因杜仲植株中的目的基因均超量表达。其中,TP4中目的基因的相对表达量最高,为对照组的10.5倍;TP7的目的基因相对表达量是对照组的7倍,TP5中的目的基因相对表达量是对照组的3.8倍。