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目的:把乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)改造为携带外源基因的复制型载体,可视化的观察HBV的表达与复制。方法:1利用PCR和分子克隆技术构建表达切开绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)1-10片段的质粒psu CMV-GFP1-10;构建表达GFP11片段的载体质粒:p CH-GFP11-Core,p CH-GFP11-Bsd R和p CH-GFP11-S2。2质粒psu CMV-GFP1-10分别与表达GFP11的载体质粒p CH-GFP11-Core,p CH-GFP11-Bsd R和p CH-GFP11-S2共转染肝癌细胞系Hep G2细胞,观察GFP表达的强度和特点。3载体质粒p CH-GFP11-Core,p CH-GFP11-Bsd R和p CH-GFP11-S2分别转染Hep G2细胞,转染后第五天提取细胞裂解液中的DNA,用southern blot检测HBV复制水平。4载体质粒p CH-GFP11-Core及表达野生型HBV的对照质粒p CH-9/3093分别转染Hep G2细胞,细胞裂解液直接进行琼脂糖凝胶电泳,转PVDF膜,应用mc312PO抗体检测重组HBV核心颗粒的形成。5质粒psu CMV-GFP1-10与载体质粒p CH-GFP11-Core共转染Hep G2细胞,转染后24h加抑制核心蛋白聚合的药物Bay41-4109,对照组加相同浓度无活性的Bay41-4842,加药后24h在荧光显微镜下观察细胞内荧光变化。6用本实验室构建保存的表达发卡状小干扰RNA(sh RNA)的质粒p BS-sh HBV6共转染Hep G2细胞,转染后48h在荧光显微镜下观察各组细胞内荧光变化。结果:第一部分:Split GFP11片段与HBV核心蛋白N端形成融合蛋白的研究1重组质粒p CH-GFP11-Core的构建:以表达野生型HBV的质粒p CH-9/3093作为载体,该载体包含1.05倍的HBV全基因组,基因组前置入了一个CMV启动子,替代HBV自身的C基因启动子,用于驱动前基因组RNA的转录。在HBV核心蛋白N端插入GFP11序列。GFP11序列为:CGG GAC CAC ATG GTG CTG CAC GAG TAC GTG AAC GCC GCC GGC ATC ACA,插入到HBV核心蛋白N端第9位核苷酸之后,再以一个亲水短肽GGC GAC GGC GGC AGC GGC GGC GGa tc C GGT连接,形成GFP11-Core融合蛋白,所构建的p CH-GFP11-Core载体质粒经酶切鉴定及序列测定证实。2重组HBV的荧光表达:质粒psu CMV-GFP1-10与载体质粒p CH-GFP11-Core共转染肝癌细胞系Hep G2细胞,转染后48h在荧光显微镜下可观察到细胞内很强的绿色荧光表达,以细胞核为主,这一结果与公认的HBV核心蛋白的正常分布一致。3重组HBV核心蛋白颗粒的形成:载体质粒p CH-GFP11-Core及表达野生型HBV的对照质粒p CH-9/3093分别转染Hep G2细胞,细胞裂解液直接进行琼脂糖凝胶电泳,转PVDF膜,应用mc312PO抗体检测到重组HBV核心颗粒的形成,二者比较在相近的电泳位置,说明GFP11-Core融合蛋白能够形成完整的核心蛋白颗粒。4重组HBV的复制能力:载体质粒p CH-GFP11-Core以表达野生型HBV的对照质粒p CH-9/3093分别转染Hep G2细胞,提取细胞裂解液中的DNA,用Southern blot检测HBV复制水平,该载体未检测到HBV复制中间体,而对照质粒p CH-9/3093可检测到HBV DNA。5荧光示踪观察Bay41-4109对HBV核心蛋白的影响:质粒psu CMV-GFP1-10与载体质粒p CH-GFP11-Core共转染Hep G2细胞,转染后24h加入1μM的抑制HBV核心蛋白聚合的药物Bay41-4109,对照组加入相同浓度无活性的Bay41-4842,加药后24h在荧光显微镜下观察荧光的变化,加用Bay41-4109组荧光主要在核膜表达,对照组荧光无变化,仍主要在胞核表达。6小干扰RNA抑制作用:用本实验室构建保存的表达发卡状小干扰RNA(sh RNA)的质粒p BS-sh HBV6与质粒psu CMV-GFP1-10和载体质粒p CH-GFP11-Core共转染Hep G2细胞,加用p BS-sh HBV6组荧光强度明显减弱,带有荧光的细胞数也显著减少。第二部分:Split GFP11片段与杀稻瘟菌素抗性基因的融合蛋白在HBV核心蛋白与P蛋白之间表达的研究1重组质粒p CH-GFP11-Bsd R的构建:以本实验室前期构建的质粒p CH-Bsd R作为载体,将GFP11与Bsd R形成融合蛋白插入HBV核心蛋白与P蛋白之间,GFP及linker序列同第一部分。2重组HBV的荧光表达:质粒psu CMV-GFP1-10与载体质粒p CH-GFP11-Bsd R共转染Hep G2细胞,转染后48h在荧光显微镜下可观察到细胞内很强的绿色荧光,胞浆和胞核均等表达。3重组HBV的复制能力:载体质粒p CH-GFP11-Bsd R以表达野生型HBV的质粒p CH-9/3093和前期构建的载体质粒p CH-Bsd R为对照分别转染Hep G2细胞,提取细胞裂解液中的DNA,用Southern blot检测HBV复制水平。该载体p CH-GFP11-Bsd R中HBV DNA的条带分布模式均与p CH-9/3093转染后相似。图像经计算机软件定量分析显示,在总DNA层面,p CH-Bsd R转染组HBV DNA的量相当于p CH-9/3093的40-45%,p CH-GFP11-Bsd R的HBV DNA量稍减,但仍可达p CH-9/3093的20%。4小干扰RNA抑制作用:用质粒p BS-sh HBV6与质粒psu CMV-GFP1-10和载体质粒p CH-GFP11-Bsd R共转染Hep G2细胞,加用p BS-sh HBV6组荧光强度明显减弱,带有荧光的细胞数显著减少。第三部分:Split GFP11与HBV前S2蛋白形成融合蛋白的研究1重组质粒p CH-GFP11-S2的构建:以表达野生型HBV的质粒p CH-9/3093作为载体,在HBV前S2区插入GFP11序列,GFP11及linker序列同第一部分,将前S1,S2的起始密码突变为ACG,GFP11与前S2形成融合蛋白,GFP11在HBV前S2起始位置。所构建的p CH-GFP11-S2载体质粒经酶切鉴定及序列测定证实。2重组HBV的荧光表达:质粒psu CMV-GFP1-10与载体质粒p CH-GFP11-S2共转染Hep G2细胞,转染后48h,在荧光显微镜下可观察到细胞内较弱的绿色荧光,荧光主要在细胞浆中散在分布。3重组HBV的复制能力:载体质粒p CH-GFP11-S2及表达野生型HBV的对照质粒p CH-9/3093分别转染Hep G2细胞,提取细胞裂解液中的DNA,用Southern blot检测HBV复制水平。该载体中HBV DNA的条带分布模式均与p CH-9/3093转染后相似。图像经计算机软件定量分析显示,在总DNA层面,p CH-GFP11-S2转染组HBV DNA的量相当于p CH-9/3093的95%,结果提示该HBV载体几乎不影响HBV的复制。4小干扰RNA抑制作用:用本实验室构建保存的表达发卡状小干扰RNA(sh RNA)的质粒p BS-sh HBV6与质粒psu CMV-GFP1-10和载体质粒p CH-GFP11-S2共转染Hep G2细胞,加用p BS-sh HBV6组荧光强度明显减弱,带有荧光的细胞数也显著减少。结论:利用绿色荧光蛋白荧光互补技术,把48bp GFP11小片段插入HBV基因组不同区域,构建了三种重组HBV载体1在HBV核心蛋白N端插入GFP11,形成融合蛋白,表达荧光强度高,能够形成核心蛋白颗粒,但失去了复制能力。可用于观察HBV核心蛋白的聚合及研究抑制HBV m RNA的药物。2在HBV核心蛋白与P蛋白之间插入GFP11-Bsd R融合蛋白,表达荧光强度高,保留约20%的复制能力。可用于观察抑制HBV复制的药物。3在HBV前S2区插入GFP11并与之融合表达,表达荧光强度较弱,但保留约95%的复制能力。可用于观察抑制HBV复制的药物。