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IKBKE(Inhibitor of nuclear factor Kappa-B Kinase subunit Epsilon)是非经典IKK激酶家族成员,在调节炎症反应、免疫细胞活化和增殖、代谢疾病等方面发挥重要作用。近年来研究表明,IKBKE作为多种肿瘤的重要致癌蛋白,可促进肿瘤的生长、增殖、侵袭和耐药,其在恶性肿瘤的发生发展中起着重要的调控作用。研究表明HMGA1(High Mobility Group A1)被认为是一种DNA结合蛋白,作为辅助因子参与调控基因转录过程,并且其在肿瘤细胞中处于高表达状态。许多研究显示转录因子ZEB2(Zinc finger E-box Binding homeobox 2)在上皮间质转化(EMT)过程中起重要作用。我们研究发现,IKBKE可以在翻译后水平调控HMGA1的蛋白表达,并对其在胞浆胞核内的分布发挥重要影响。HMGA1通过结合ZEB2的启动子区域进而在转录水平对其进行调控,进一步研究得出IKBKE对胶质瘤细胞的迁移和侵袭以及增殖能力的作用。这些研究表明沉默IKBKE可以抑制胶质瘤细胞的恶性进展,IKBKE发挥癌基因作用是通过IKBKE-HMGA1-ZEB2轴对胶质瘤细胞的恶性进展进行调控,从而证明针对IKBKE的治疗是治疗恶性胶质瘤细胞的发生发展的重要靶点。方法1、应用蛋白免疫印迹实验(WB)和q RT-PCR首先确定IKBKE,HMGA1以及ZEB2在六种胶质瘤细胞系中蛋白表达以及m RNA表达情况;2、运用WB分别验证转染IKBKE-sh RNA和过表达IKBKE质粒后,U87和SNB19细胞系中IKBKE,HMGA1和ZEB2以及EMT相关其他指标蛋白表达情况,同时运用WB验证转染HMGA1-sh RNA后,U87和SNB19细胞系中HMGA1和ZEB2以及EMT相关其他指标蛋白表达情况;3、运用q RT-PCR方法检测敲低IKBKE和过表达IKBKE后,IKBKE,HMGA1和ZEB2在U87和SNB19细胞系中m RNA的表达情况,同时证明转染HMGA1-sh RNA后,U87和SNB19细胞系中HMGA1和ZEB2的m RNA表达情况;4、运用CCK8实验分别检测敲低IKBKE和敲低HMGA1后对胶质瘤细胞的增殖能力的影响;5、运用划痕实验和Transwell实验检测转染IKBKE-sh RNA和HMGA1-sh RNA后对胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力的影响;6、运用WB和免疫荧光实验证明敲低IKBKE后,HMGA1在U87和SNB19细胞中胞浆和胞核内的变化;7、运用免疫共沉淀和WB证明IKBKE与HMGA1是否存在内源性结合,以及敲低IKBKE后HMGA1泛素化水平变化。8、运用蛋白序列分析预测IKBKE能否磷酸化HMGA1,运用WB联合使用phos-tag磷酸化胶证明IKBKE是否可以磷酸化修饰HMGA1;9、染色质免疫共沉淀(Ch IP)和双荧光素酶报告实验(luciferase assay)证明转录因子HMGA1是否可以结合ZEB2启动子区域对其进行调控;10、运用立体定向技术在裸鼠颅内种瘤建立模型,记录裸鼠生存时间,ICH证明IKBKE,HMGA1以及ZEB2的蛋白表达变化。结果1、蛋白免疫印迹实验(WB)和q RT-PCR显示IKBKE,HMGA1以及ZEB2在U87和SNB19细胞系中蛋白表达以及m RNA表达水平均较高;2、WB显示敲低IKBKE表达后,IKBKE,HMGA1和ZEB2以及EMT相关其他指标蛋白表达均下降,反之,过表达IKBKE则蛋白表达升高。敲低HMGA1后,HMGA1和ZEB2以及EMT相关其他指标蛋白表达均下降;3、q RT-PCR显示敲低IKBKE后,IKBKE和ZEB2的m RNA表达下降,HMGA1的m RNA表达未见明显改变;同理过表达IKBKE后,IKBKE和ZEB2的m RNA表达升高,HMGA1的m RNA表达未见明显改变。敲低HMGA1后,HMGA1和ZEB2的m RNA表达均下降;4、U87和SNB19细胞分别转染IKBKE-sh RNA和HMGA1-sh RNA后抑制胶质瘤细胞的增殖能力;5、U87和SNB19细胞分别转染IKBKE-sh RNA和HMGA1-sh RNA后抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力;6、敲低IKBKE后,在U87和SNB19细胞中HMGA1在胞浆内的蛋白表达水平升高,在胞核内的蛋白表达水平降低;7、IKBKE可以直接与HMGA1相结合,敲低IKBKE后可以促进HMGA1的泛素化和降解,使用蛋白酶体抑制剂(MG132)作用后,IKBKE抑制HMGA1降解的过程被抑制,使用蛋白合成抑制剂CHX(放线菌酮)作用后,敲低IKBKE后HMGA1降解速度明显加快。8、蛋白序列分析表明IKBKE磷酸化HMGA1的Ser 36和/或Ser 44位点,同时运用WB联合使用phos-tag磷酸化胶证明IKBKE可以磷酸化修饰HMGA1;9、HMGA1可以结合ZEB2启动子区域,证实HMGA1在转录水平调控ZEB2的表达水平;10、U87细胞系分别敲低IKBKE和HMGA1后,显著抑制裸鼠模型颅内肿瘤的生长情况,延长生存时间,ICH证实敲低IKBKE后,IKBKE,HMGA1和ZEB2蛋白表达均下降,同时敲低HMGA1后,HMGA1和ZEB2以及EMT相关其他指标蛋白表达均下降。结论1、沉默IKBKE表达后,显著抑制恶性胶质瘤细胞的增殖,迁移以及侵袭等恶性进展过程。2、IKBKE可以直接结合HMGA1,IKBKE磷酸化HMGA1的Ser 36和/或Ser 44位点,在翻译后水平调控HMGA1,敲低IKBKE后促进HMGA1的泛素化和降解情况,降低HMGA1的磷酸化水平,抑制上皮间质转化(EMT)进程,显著抑制恶性胶质瘤细胞的进展。3、HMGA1可以直接结合ZEB2的启动子区域,在转录水平调控促进ZEB2表达水平升高,敲低HMGA1后,显著抑制上皮间质转化(EMT)进程。4、本研究首先提出IKBKE-HMGA1-ZEB2轴调控胶质瘤细胞增殖和侵袭的新机制,为治疗胶质母细胞瘤提供了新的方向。