1.研究背景及目的1.1研究背景：妊娠期高血压疾病(]hypertensive disorder complicating pregnancy, HDCP)是妊娠期特有的疾病,以高血压和／或蛋白尿为最早出现临床症状,随后出现脑、心、肝、肾等多脏器损害为结果的临床过程,是增加孕产妇及胎儿发病率和死亡率的主要原因之一,其发生率在我国9.4%,国外报道2%-10%[1,2],已经成为全球性的人类健康问题。近年来,子痫前期病因及发病机制的研究一直是产科的热点,其中研究比较热门的是血管内皮损伤学说、胎盘缺血缺氧学说、免疫学说、遗传学说和滋养细胞凋亡调节异常学说等。临床病理研究已证实,子痫前期的病理改变发生在临床症状出现前,表现为胎盘浅着床、体积小、绒毛数量减少、血管内皮功能障碍、间质纤维化和免疫平衡失调等。子痫前期发病越早,预后越差,孕周越小,母亲的并发症越多,胎死宫内和围生儿死亡率也越高。新生儿患病率和病死率也与孕周相关,孕周越小,发病率越高。早发型重度子痫前期发生在24孕周前,其围生儿几乎不能存活。子痫前期的发病机制相当复杂,到目前为止尚无准确的手段预测某个体是否会发生子痫前期。尽管子痫前期的病因不十分明确,但是内皮细胞损伤、炎症反应和凝血功能异常在子痫前期发病机制中的作用越来越受到重视,而细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、P-选择素(P-selectin)、D二聚体(D-dimer)是与内皮损伤、炎症和凝血密切相关的因子,本研究将进一步探讨其与子痫前期的相关性。ICAM-1参与中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞与血管内皮的黏附,对白细胞向炎症区移行及淋巴细胞归巢和再循环起重要作用。孙国强等[3]报道,子痫前期患者胎盘合体滋养细胞ICAM-1表达增强,ICAM-1阳性滋养细胞侵入蜕膜血管伴血管周围淋巴细胞浸润,这说明子痫前期患者胎盘有炎症反应伴血管内皮细胞受损。通过注射抗ICAM-1抗体可以阻断体内ICAM-1介导的T细胞与上皮细胞、内皮细胞和抗原提呈细胞黏附的过程[4],这为子痫前期的治疗提供了新的途径。P-selectin对血栓的形成起着始动作用,是目前已知反映血小板活化、释放的特异标记物,而血小板的活化是子痫前期发病的重要因素[5]。高表达的P-选择素可通过细胞初始黏附介导血小板、内皮细胞黏附以及这些细胞与白细胞的相互作用,启动炎症反应、血栓形成以及血管内皮的损伤。Ramacciotti等[6]研究表明,抑制P-selectin能够减少血栓形成,并加快溶栓和毛细血管的再通。Akolekar等[7]研究表明早在子痫前期发病前的数个月就有母体血浆P-selectin的升高,故P-selectin可作为血栓形成早期的一个分子标记物,了解血小板活化程度,预测子痫前期的发生。D-dimer是交联纤维蛋白的特异性降解产物,是体内高凝状态和纤溶亢进的特异性分子标志物,对静脉血栓的形成具有较高的阴性预测价值。正常妊娠机体D-dimer高于未妊娠者,血液处于高凝状态,这对于减少分娩过程中出血具有重要作用[8]。子痫前期患者胎盘缺血、缺氧、炎症反应,滋养细胞异常侵蚀,导致毛细血管内皮细胞损伤,全身及胎盘毛细血管通透性增高,微血栓形成,血液处于高凝及纤溶亢进状态,升高的D-dimer可反映内皮细胞的受损情况[9],同时可作为判断子痫前期病情严重程度的重要依据之一。中性粒细胞对血管内皮损伤首先需在黏附分子介导下与血管内皮细胞结合,而ICAM-1是这种介导作用的最重要黏附分子,可以加速内皮细胞的损伤,进而促进血小板与内皮细胞黏附,受到炎症因子刺激的血小板a颗粒和内皮细胞棒状(Weibel-Palade)小体中的P-selectin活化并释放入血,与活化的白细胞和内皮细胞表面P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)结合,使中性粒细胞和血小板激活,释放炎症介质,增强炎症反应,促进血小板的黏附和聚集[10],ICAM-1和P-selectin水平大幅上调,彼此促进,相互作用,对进一步扩大血栓的形成具有关键作用[11],并通过激活外源性凝血途径,产生纤维蛋白,引发血栓前高凝状态,进而机体纤溶亢进,引起D-dimer升高。综上所述,ICAM-1、P-selectin和D-dimer的异常表达可能与子痫前期的发病密切相关,各个因子间可能相互关联,但其具体作用机制尚不明确。本文将进一步探讨各个因子间及其与子痫前期发病的相关性,深入研究子痫前期的发病机理。1.2研究目的：①探讨ICAM-1、P-selectin和D-dimer在子痫前期患者母体血浆的表达及其相关性；②探讨ICAM-1、P-selectin和D-dimer在子痫前期患者脐带血浆的表达及其相关性；③探讨ICAM-1和P-selectin在子痫前期患者胎盘组织的表达及其相关性。2.方法2.1病例来源：选择2013年2月至9月在深圳市妇幼保健院住院分娩的子痫前期产妇47例为研究组,另选同期正常晚期孕妇45例(无内外科合并症妊娠者)为对照组。子痫前期的诊断以谢幸、苟文丽主编的第8版《妇产科学》为标准。研究对象的孕周采用末次月经和超声评估的方法确立,研究对象均为单胎妊娠,研究组除子痫前期外无慢性高血压、糖尿病、心脏病、肝肾疾病、甲状腺疾病等内外科合并症。2.2实验方法：①标本处理：产妇于入院后采静脉血3ml,用3.2%柠檬酸钠抗凝,在-4℃和3000r/min的条件下离心10min,取上层血浆-80℃冻存待检；产妇分娩断脐后,立即在近胎盘一侧的脐带处采集脐动脉血3ml,用3.2%柠檬酸钠抗凝,在-4℃和3000r/min的条件下离心10min,取上层血浆-80℃冻存待检；胎盘娩出后立即在近脐根部母体面(避开出血及钙化区)取1.Ocmx1.0cmx0.2cm大小的组织,用无菌生理盐水冲洗,去除组织表面血液及粘液成分,置于10%中性福尔马林溶液固定24h后,常规石蜡包埋保存。②酶联免疫吸附实验：血浆标本于室温解冻后,立即在4℃以3000转离心2分钟,取一定量上清液,采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法测定各组孕妇及其脐带血浆ICAM-1、P-selectin和D-dimer浓度,读取OD值,根据标准品OD值绘制出标准曲线并得出曲线方程,计算出各个OD值的对应浓度值。③免疫组织化学技术：将石蜡组织块取4um厚连续切片,按试剂说明书采用SABC法检测ICAM-1、P-selectin在胎盘组织中的表达。采用半定量法评估胎盘组织蛋白的表达：阳性细胞的细胞核或细胞浆内有棕黄色颗粒物质；阴性细胞的细胞核为蓝色,细胞浆无染色或与背景相近。在显微镜下观察切片上组织细胞的蛋白表达情况,并在200倍视野下每张切片随机选取5个视野拍照,用Image pro plus6.0(IPP6.0)图像软件分析并测定照片中阳性细胞积分光密度值(IOD)。2.3统计方法：采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学分析,数据进行正态性检验和方差齐性分析后,若方差齐则采用两独立样本的t检验,若方差不齐则采用两独立样本的非参数检验。对子痫前期组数据进行双变量相关分析,若数据服从正态分布,采用Pearson相关分析；若数据不服从正态分布,采用Spearman相关分析。数据均以a=0.05为检验水准,P<0.05差异具有统计学意义。3.结果3.1临床一般资料分析：两组间孕妇的年龄、孕周差异无统计学意义(P>0.05)；子痫前期组的平均动脉压大于正常妊娠组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.2ICAM-1、P-selectin和D-dimer在两组的母体血浆中均有表达,其在子痫前期组母体血浆的浓度均高于正常妊娠组的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.3ICAM-1、P-selectin和D-dimer在两组脐血浆中均有表达,其在子痫前期组脐血浆的浓度均高于正常妊娠组的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.4ICAM-1、P-selectin在各组胎盘组织中均有表达,ICAM-1主要表达于胎盘合体滋养细胞和绒毛血管内皮细胞上,定位在胞膜和胞浆中；P-selectin主要表达于合体滋养细胞、血管内皮细胞及间质细胞,定位在胞膜和胞浆中。ICAM-1、 P-selectin在子痫前期组胎盘组织的表达均高于正常妊娠组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.5相关分析：①子痫前期组的母体血浆：ICAM-1与P-selectin的表达呈正相关(r=0.474),P-selectin与D-dimer的表达呈正相关(r=0.534), ICAM-1与D-dimer的表达呈正相关(-r=0.501)。②子痫前期组的脐血浆：ICAM-1与P-selectin的表达呈正相关(r=0.518),P-selectin与D-dimer的表达呈正相关(r=0.366), ICAM-1与D-dimer的表达呈正相关(r=0.559)。③子痫前期组的胎盘组织：ICAM-1与P-selectin的表达呈正相关(r==0.510)。4.结论4.1ICAM-1、P-selectin和D-dimer在正常母血、脐血和母胎界面(胎盘)均有表达,说明这些因子的生理性表达对正常妊娠的维持有一定积极作用。4.2ICAM-1、P-selectin和D-dimer在子痫前期患者母血、脐带血和母胎界面(胎盘)的表达同时升高,说明这三个因子可能参与了子痫前期的发病,并且可能是母体、胎盘和胎儿之间共同交互作用的结果,也进一步说明子痫前期发病机制的复杂性。4.3子痫前期组ICAM-1、P-selectin和D-dimer在母血、脐血和胎盘组织的表达均呈正相关,说明这些因子间可能相互关联,在母体、胎盘和胎儿之间交互作用,在子痫前期发病机制及病情进展上有一定的相关性。