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1目的:通过检测父方来源而母方印记的遗传印记基因PEG10 (paternally expressed gene 10)在正常早期妊娠妇女和难免流产患者蜕膜组织中的表达水平及其组织学定位,研究PEG10在正常早期妊娠及难免流产蜕膜组织的表达规律,探讨其在自然流产中的作用,并为难免流产病因的深入研究提供新的思路。方法:选取2006年10月至2007年8月在重庆医科大学第一附属医院妇产科门诊自愿接受人工流产术中止妊娠的正常早孕妇女和难免流产患者,其中正常早孕60例,停经6~11周,每孕周组各10例,年龄20~32岁,经妇科检查、B超证实为宫内妊娠且符合孕周;难免流产患者40例,停经6~9周,每孕周组10例,年龄20~35岁,经妇科检查、B超诊断而确认为难免流产胚胎停育者(包括胚囊小于孕周或未见胚芽或未见原始心管搏动)。在无菌条件下获取她们的妊娠蜕膜组织,提取总RNA并留取部分新鲜组织用4﹪的多聚甲醛固定。分别采用半定量逆转录聚合酶反应(RT-PCR)、原位杂交、免疫印迹(Western blotting)、免疫组织化学及激光共聚焦技术检测蜕膜组织PEG10mRNA及蛋白的表达水平与组织定位。结果:1. RT-PCR显示PEG10 mRNA在各孕周蜕膜组织中均有表达,且表达量随孕周增加逐渐上调。在妊娠第6周表达量较低(0.6743±0.114),随后表达量上升(第7周0.7349±0.0083),至第8周达高峰(0.7354±0.0074),继而出现下调趋势(第9周0.6340±0.0084、第10周0.5901±0.0089、第11周0.5261±0.0112);而在孕6-9周难免流产蜕膜组织中表达量明显下降,和同期正常早期妊娠各孕周组相比均具有显著性差异(P<0.05)。2.原位杂交分析PEG10 mRNA的表达规律与RT-PCR结果相吻合。其阳性信号定位于间质和胞质及腺上皮,呈散在、局灶或弥漫状分布,以腺上皮表达最强,为紫蓝色细砂样至黑紫色粗颗粒状;胞质次之,间质最弱。而在孕6~9周难免流产蜕膜组织中腺上皮呈弱蓝色,胞质、间质几乎无阳性着色信号。3.免疫组化、激光共聚焦、Western blot亦显示PEG10蛋白表达规律与其mRNA表达规律相符。IHC显示,PEG10表达定位于在蜕膜间质细胞和腺上皮细胞胞浆,胞核不表达。正常妊娠6~11周蜕膜组织PEG10表达强度为(+++)—(++++)—(+++),而在孕6~9周难免流产蜕膜组织其表达强度仅为(+);LSCM观察发现免疫荧光染色的阳性细胞定位与蜕膜间质细胞和腺上皮细胞的胞浆,正常妊娠6~11周蜕膜组织表达规律同IHC;WB显示各样本均于80 kDa及43 kDa处出现目的及内参蛋白,其中目的蛋白与基因库公布PEG10 ORF1/ORF2蛋白的大小相吻合。结论:1.遗传印记基因PEG10在正常早期妊娠蜕膜组织中维持一定高水平表达是保证妊娠得以顺利进行的一个重要因素。可能是父方来源的基因对促进和维持蜕膜和胚胎生长发育发挥了重要的作用。2. PEG10 mRNA及其蛋白在难免流产蜕膜组织表达量远远低于早期正常妊娠蜕膜组织,进一步证明PEG10的表达水平与胚胎发育密切相关,其表达量下降可能是导致难免流产的重要原因之一。研究结果提示PEG10的低表达可能成为流产诊断和防治的新靶点。3.本实验所采用的实验技术为探索流产诊治中高敏感度、高特异性的诊断新方法打下实验基础。