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骨缺损修复是骨科领域的医学难题。传统的骨修复材料构建方法不能满足适配患者的个体化需求,材料仿生效果差,治疗效果不理想。3D生物打印是组织修复材料构建领域的一门新兴技术,可将活细胞混合到生物材料中按照需求打印成具有功能的组织结构。3D生物打印可以根据个体的实际情况设计模型,从而精准化制备与个体匹配的组织结构。明胶/海藻酸钠均为天然的聚合物,因具有较好的流变性能和生物相容性,常常被用作3D生物打印的墨水。课题组前期研究发现纳米硅酸镁锂可促进BMSCs成骨分化,并且在水凝胶中亦可促进骨质修复;然而,在混合硅酸镁锂的水凝胶中BMSCs密度对其矿化和成骨能力的影响却鲜有研究。在本研究中我们将BMSCs的接种密度作用作为研究目标,使用明胶/海藻酸钠/硅酸镁锂复合水凝胶作为生物墨水,3D生物打印出不同细胞密度的水凝胶复合体并对其生物医学特性进行研究。研究目的生物墨水的调配是3D生物打印的关键步骤,其中细胞的密度又是其中关键参数。因此本研究使用3D生物打印的方法制备不同细胞密度的水凝胶复合体,对水凝胶复合体的性能进行表征,并通过体外和体内实验探讨不同细胞密度的水凝胶复合体的矿化和成骨能力。研究方法第一部分我们使用西安点云生物公司提供的3D生物打印机,按照打印机的使用操作规程制定水凝胶复合体模型打印程序;培养大鼠BMSCs并通过流式细胞术对其表型进行鉴定,将BMSCs与明胶/海藻酸钠/硅酸镁锂复合水凝胶混合制备不同细胞密度的生物墨水（T0、T5、T6、T7、T8组,细胞密度分别为0,1×10~5/ml,1×10~6/ml,1×10~7/ml,1×10~8/ml）,执行打印程序制备几组不同细胞密度的水凝胶复合体。第二部分中我们使用X射线衍射（XRD）和傅里叶红外光谱（FTIR）分析各种原材料和复合水凝胶复合体的组分构成,运用单轴压缩试验测定各组水凝胶材料的应力应变曲线并计算压缩模量,冻干法测定各组打印水凝胶复合体的水合性能,通过显微镜观察打印后细胞在水凝胶复合体内的分布情况,并且利用细胞骨架染色观察细胞伸展情况,培养3d、7d、14d后行活/死细胞染色观察细胞在水凝胶复合体内的存活率,用以评价细胞的生存状态。第三部分我们将各组水凝胶复合体在体外培养不同时间后,通过茜素红染色观察水凝胶复合体矿化的程度,借助EDS能谱分析矿化结节的成分,然后从水凝胶复合体中解离出细胞后测定相应的碱性磷酸酶（ALP）活性,采用q RT-PCR测定各组细胞Runx2、OSX、ALP、OCN、Col1a等成骨相关基因的表达。第四部分我们将各组水凝胶复合体分别植入到大鼠的臀后肌袋内,分别于术后2周、4周、8周取材,采用X线摄片和micro-CT扫描及三维重建观察矿化成骨情况,利用EDS能谱分析植入物的元素构成,然后采用免疫荧光染色确定成骨蛋白的生成,通过Masson染色观察胶原的生成以及天狼猩红染色确定胶原的分型。研究结果第一部分3D打印机操控及复合体制备生物打印机可便捷的进行连接,通过打印机软件生成水凝胶复合体模型;应用干细胞贴壁的特性分离提纯原代BMSCs,并且鉴定得出BMSCs纯度在95%以上;按照不同细胞密度制备生物墨水,运行程序制备出不同细胞密度的水凝胶复合体。第二部分水凝胶复合体的表征与生物学评价XRD和FTIC分析发现水凝胶复合体的吸收峰包含了所有原材料的特征峰,表明各种原材料在复合物中均存在,单轴压缩试验发现应力与应变基本上呈线性关系,应力随应变的增大而增大,1×10~8/ml组的压缩模量小于其他组（P＜0.05）。各组水凝胶复合体水和性能良好,含水膨胀率及含水量均无统计学差异（P＞0.05）,显微镜下观察细胞均匀分布于水凝胶复合体内,T6和T7组细胞可见梭形伸展,骨架染色能看到细胞在水凝胶复合体内自由伸展、分裂和相互接触;活/死染色发现体外培养3d、7d、14d时T5、T6、T7组的细胞存活率均在90%以上,而T8组却低于90%。第三部分水凝胶复合体的体外矿化研究在体外培养7d、14d、21d后,茜素红染色发现含细胞的T5、T6、T7、T8组水凝胶复合体上均有红色结节,说明有矿化结节的生成,而不含细胞的T0组几乎没有红色结节;水凝胶复合体上结节的EDS能谱发现钙磷比例1.38,接近于羟基磷灰石;ALP活性检测发现在14d后T7组的ALP活性要高于其他组,q RT-PCR测定发现T7组在7d时的Runx2、OSX和14d时ALP、OCN、Col1a表达量高于其他各组。第四部分水凝胶复合体植入肌袋内异位成骨研究X线和micro-CT扫描及三维重建发现T5、T6、T7、T8组均有矿化成骨,而T0组有极少的成骨量,植入物EDS能谱分析钙磷比例1.45,更加接近羟基磷灰石;成骨相关蛋白免疫荧光染色发现Runx2、OSX、OCN在T6、T7、T8组都有较为明显的产生,而Col1a在T7组的生成量多于其他各组;Masson和天狼猩红染色发现T7组的胶原生成量最多且Ⅰ/Ⅲ型胶原比例最大。研究结论本研究借助3D生物打印技术,建立模型配制不同BMSCs密度的生物墨水,制备不同细胞密度的水凝胶复合体。细胞能均匀的分布于水凝胶复合体内部,可自由伸展和增殖;较大的细胞密度（1×10~8/ml）可降低水凝胶的机械性能,并且细胞存活率较低,而细胞密度在1×10~7/ml以下时则不影响水凝胶的机械强度,且可保持较高的细胞存活率。通过体内外研究可得出,含细胞的水凝胶复合体能够矿化和异位成骨,成骨的效果与水凝胶复合体内复合细胞的密度有关,在BMSCs密度为1×10~7/ml时含细胞水凝胶复合体能够发挥最优的矿化和成骨性能。