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背景:日光紫外辐射(UV)常常会导致皮肤炎症甚至肿瘤等皮肤问题。传统的紫外防护化合物多因其副作用而导致应用受限,因此,研发高效无副作用的紫外防护的化合物显得十分重要。近年来,天然化合物以其抗炎、抗氧化的能力为皮肤提供多方长效保护作用而成为研究热点。传统中草药黄连具有抗炎抗氧化效应,甲基黄连碱是其有效单体成分,但在日光性皮炎中作用及其机制研究未知。
目的:探讨甲基黄连碱在预防紫外诱导的皮炎中的作用及分子机制。
方法:(1)采用计算机辅助筛选法和体外激酶筛选实验(kinase array),发现甲基黄连碱的候选靶标分子:JNK2。
(2)原核表达并纯化GST-JNK2蛋白,采用微量热泳动实验(MST)分析甲基黄连碱与JNK2相互作用及结合常数。
(3)体外激酶实验分析甲基黄连碱对JNK2活性抑制作用。
(4)通过MTT实验,观察不同浓度的甲基黄连碱对JB6Cl41和HaCaT细胞的活性影响。
(5)建立UV诱导的日光性皮炎细胞模型,并用不同浓度甲基黄连碱预处理不同时间,收集细胞培养上清、裂解细胞提取蛋白,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清中IL-6浓度,免疫印迹实验(Western Blot)分析p38、JNK2信号通路相关分子表达。
(6)裸露BALB/c小鼠背部皮肤,UV照射,建立UV诱导的日光性皮炎动物模型,用甲基黄连碱药膏预处理受照射皮肤,24h后采集皮肤,分为两份,一份进行H&E染色,观察皮肤病理变化;一份采用液氮研磨法提取皮肤组织蛋白,采用ELISA检测皮肤组织中炎症因子IL-6的含量,蛋白免疫印迹实验测皮肤组织中JNK2、p38相关信号通路因子的表达。
结果:(1)甲基黄连碱可以结合JNK2,KD值为116.41μM并呈以剂量依赖方式抑制JNK2活性。
(2)甲基黄连碱预处理HaCaT细胞,抑制紫外诱导JNK2、p38和转录因子ATF2的磷酸化,抑制炎症因子IL-6的分泌。
(3)甲基黄连碱能够减轻紫外照射引起的小鼠皮肤表皮增厚和炎性细胞浸润, 抑制了皮肤组织中UV诱导的JNK2、p38磷酸化水平上调及IL-6分泌增加。
结论:(1)甲基黄连碱是JNK2的抑制剂。(2)甲基黄连碱抑制JNK2,减轻紫外造成的皮肤损伤。(3)甲基黄连碱可开发为预防和治疗日光性皮炎的药物。
目的:探讨甲基黄连碱在预防紫外诱导的皮炎中的作用及分子机制。
方法:(1)采用计算机辅助筛选法和体外激酶筛选实验(kinase array),发现甲基黄连碱的候选靶标分子:JNK2。
(2)原核表达并纯化GST-JNK2蛋白,采用微量热泳动实验(MST)分析甲基黄连碱与JNK2相互作用及结合常数。
(3)体外激酶实验分析甲基黄连碱对JNK2活性抑制作用。
(4)通过MTT实验,观察不同浓度的甲基黄连碱对JB6Cl41和HaCaT细胞的活性影响。
(5)建立UV诱导的日光性皮炎细胞模型,并用不同浓度甲基黄连碱预处理不同时间,收集细胞培养上清、裂解细胞提取蛋白,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清中IL-6浓度,免疫印迹实验(Western Blot)分析p38、JNK2信号通路相关分子表达。
(6)裸露BALB/c小鼠背部皮肤,UV照射,建立UV诱导的日光性皮炎动物模型,用甲基黄连碱药膏预处理受照射皮肤,24h后采集皮肤,分为两份,一份进行H&E染色,观察皮肤病理变化;一份采用液氮研磨法提取皮肤组织蛋白,采用ELISA检测皮肤组织中炎症因子IL-6的含量,蛋白免疫印迹实验测皮肤组织中JNK2、p38相关信号通路因子的表达。
结果:(1)甲基黄连碱可以结合JNK2,KD值为116.41μM并呈以剂量依赖方式抑制JNK2活性。
(2)甲基黄连碱预处理HaCaT细胞,抑制紫外诱导JNK2、p38和转录因子ATF2的磷酸化,抑制炎症因子IL-6的分泌。
(3)甲基黄连碱能够减轻紫外照射引起的小鼠皮肤表皮增厚和炎性细胞浸润, 抑制了皮肤组织中UV诱导的JNK2、p38磷酸化水平上调及IL-6分泌增加。
结论:(1)甲基黄连碱是JNK2的抑制剂。(2)甲基黄连碱抑制JNK2,减轻紫外造成的皮肤损伤。(3)甲基黄连碱可开发为预防和治疗日光性皮炎的药物。