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糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)患者容易发生动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),且时间早,进展快、范围广、预后差,即所谓加速性AS,是DM致死、致残的重要原因。研究表明,持久的高血糖状态可导致DM患者体内许多结构和功能蛋白质、脂质甚至核酸发生糖基化,经过一系列非酶促反应,即Maillard反应,形成Schiff碱,经Amadori反应重排后,最终形成具有高度活性、结构多样的糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs),后者通过与细胞表面特异性AGEs受体(receptor for AGEs,RAGE)相互作用而发挥一系列的血管病理作用,加速糖尿病性AS的发生、发展。泡沫细胞形成是AS发生的早期事件和关键环节,胆固醇酯在巨噬细胞中大量沉积则是泡沫细胞形成的重要原因,这一过程受清道夫受体、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(acyl-coenzyme A: cholesterolcyl transferase-1,ACAT-1)和ATP结合盒转运子(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)共同调节。ACAT-1是细胞内唯一催化游离胆固醇和长链脂肪酸酯化形成胆固醇酯的酶,在单核/巨噬细胞中主要以ACAT-1形式存在。病理条件下,巨噬细胞ACAT-1高表达,导致细胞内胆固醇酯大量堆积而形成泡沫细胞,这就是AS的早期病变,可见ACAT-1是巨噬细胞源性泡沫细胞形成的主要介导者。然而,有关AGEs促发巨噬细胞源性泡沫细胞形成的作用是否与巨噬细胞ACAT-1的表达变化有关,目前尚不清楚。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ, PPARγ)是一类由配体活化的核转录因子,属于核受体超家族成员,与脂肪细胞分化、炎症反应、胰岛素敏感性、细胞周期调节、AS及肿瘤等关系密切。研究表明,PPARγ在单核细胞分化为巨噬细胞时表达,在维持巨噬细胞脂质代谢平衡过程中占有主导地位,但目前对于核受体PPARγ在加速性AS发生、发展中的作用尚有争议。此外,核受体PPARγ是否调节着巨噬细胞ACAT-1的转录尚未见报道。目的本研究试图从AGEs影响巨噬细胞ACAT-1和PPARγ及其下游基因表达这一角度,阐明AGEs促发AS巨噬细胞源性泡沫细胞形成的作用机制。为此,我们以体外培养的THP-1细胞为实验对象,进行以下研究:1、AGEs对巨噬细胞ACAT-1基因表达的影响; 2、AGEs对巨噬细胞核受体PPARγ及其下游SR-A基因表达的影响;3、研究比较巨噬细胞ACAT-1与PPARγ之间的相关性;4、通过观察PPARγ的合成型配体罗格列酮对AGEs诱导的巨噬细胞ACAT-1表达的作用,探讨PPARγ活化在糖尿病性AS中发挥血管保护作用可能的机制。方法1.按标准的方法用D-葡萄糖和牛血清白蛋白(BSA)共同孵育12周制备糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA),即AGEs。2. THP-1单核细胞培养于RPMI1640完全培养液中,于37℃、5%CO2培养箱中静置培养,每隔3～5天传代一次。用终浓度为0.1μM的PMA诱导THP-1单核细胞72h,使其分化成巨噬细胞。3.分别用浓度为50、100、200和400mg/L的AGE-BSA干预巨噬细胞24h,以100mg/L BSA作为对照组。同时用200mg/L AGE-BSA分别处理细胞0、12、24、36h和48h。4.运用免疫细胞化学方法检测巨噬细胞PPARγ及其下游SR-A的表达,了解AGEs对巨噬细胞PPARγ和SR-A蛋白表达的影响。5.运用RT-PCR和Western blot方法检测巨噬细胞ACAT-1和PPARγ基因和蛋白的表达,同使用EMSA检测巨噬细胞PPARγ的DNA结合活性,了解AGEs对巨噬细胞ACAT-1和PPARγ表达的影响。6.分别以PPARγ激动剂和PPARγ抗体刺激巨噬细胞,运用RT-PCR和Western blot方法检测巨噬细胞PPARγ和ACAT-1基因和蛋白的表达情况,明确巨噬细胞ACAT-1和PPARγ之间的相关性。7.以PPARγ激动剂罗格列酮预处理巨噬细胞4h,再用AGE-BSA刺激巨噬细胞,运用RT-PCR和Western blot方法检测巨噬细胞ACAT-1基因和蛋白的表达,明确罗格列酮对AGEs诱导的巨噬细胞ACAT-1表达的影响。结果1.荧光分光光度计上分别测定AGE-BSA和BSA的荧光值,AGE-BSA为180.5荧光单位/mg蛋白,BSA为2.98荧光单位/mg蛋白。2.经0.1μmol/L PMA诱导72h后,THP-1细胞形态由圆形变为梭形、椭圆形或不规则型,由悬浮状态向贴壁状态转化,细胞体积增大,呈阿米巴样贴壁生长,伸出伪足,富含颗粒,具有巨噬细胞的特点,转化率超过85%。3.与对照组相比,AGE-BSA可使巨噬细胞ACAT-1 mRNA和蛋白的表达水平显著上调(P<0.05),而核受体PPARγmRNA和蛋白的表达水平则显著降低(P<0.05),二者均呈现良好的浓度和时间依赖性。此外,EMSA结果显示,AGE-BSA还可浓度依赖性地抑制巨噬细胞PPARγ的DNA结合活性(P<0.05)。4.免疫细胞化学法结果显示,AGE-BSA显著抑制巨噬细胞PPARγ表达的同时,还可显著上调SR-A蛋白的表达水平(P<0.05)。5.与对照组相比,PPARγ激动剂刺激后,巨噬细胞PPARγmRNA和蛋白的表达量明显增加,而ACAT-1 mRNA和蛋白的表达量则明显降低(P<0.05);相反,PPARγ抗体刺激后,巨噬细胞PPARγmRNA和蛋白的表达量显著降低,而ACAT-1 mRNA和蛋白的表达量则显著增加(P<0.05)。6.给予1μM、5μM和10μM的罗格列酮预处理后,AGE-BSA诱导的巨噬细胞ACAT-1 mRNA和蛋白的表达量均较对照组显著下降(P<0.05)。结论1. AGE-BSA可明显增强巨噬细胞ACAT-1 mRNA和蛋白的表达水平,呈浓度和时间依赖性。2. AGE-BSA不仅可显著下调巨噬细胞核受体PPARγmRNA和蛋白的表达水平,还可浓度依赖性地抑制PPARγ的DNA结合活性。3. AGE-BSA通过上调巨噬细胞表面SR-A蛋白的表达水平,促进巨噬细胞摄取脂质,有利于泡沫细胞形成。4. PPARγ配体可使巨噬细胞PPARγ表达增强,ACAT-1表达减弱;而PPARγ抗体则使PPARγ表达减弱,ACAT-1表达增强,说明PPARγ与ACAT-1之间存在明显的负相关性。5. PPARγ特异性激动剂--罗格列酮可显著抑制AGE-BSA诱导的巨噬细胞ACAT-1 mRNA和蛋白的表达水平,此效应在一定浓度范围内呈浓度依赖性,表明PPARγ活化可通过转录调节ACAT-1的表达,从而阻止胆固醇酯在巨噬细胞内大量蓄积,最终抑制AGEs促发的巨噬细胞源性泡沫细胞形成。