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目的:1、通过热敏灸“命门”穴来探讨穴位周围结缔组织及脊髓在热敏灸刺激下是如何发生形态学改变的,并通过不同疗程时间对此深入探讨。2、通过SP法,观察在不同热敏灸时间作用下浅筋膜和脊髓中的ERK1/2和P38蛋白的表达情况并通过Western-Blot法半定量观察在不同热敏灸时间作用下,以确定最佳热敏灸的疗程时间。3、通过比较“命门”穴和“足三里”穴在热敏灸治疗骨质疏松症中结果的异同探讨不同热敏态穴位对热敏灸疗效机理的影响。4、通过对大鼠血清中磷、钙离子、碱性磷酸酶浓度进行测量,从生化角度探索热敏灸在体内产生的作用效果。5、通过上述步骤探讨热敏灸产生疗效的机理。方法:1、OVX法制得大鼠骨质疏松模型:将清洁级SD雌性大鼠随机分组,备皮麻醉后顺势摘除两侧卵巢,制得骨质疏松症大鼠模型,造模后取阴道分泌物进行瑞氏染色,观察阴道上皮细胞和白细胞的数量变化,以证明去势成功。2、HE染色观察热敏灸对浅筋膜及脊髓形态学的改变:将患骨质疏松症大鼠随机分成五组,取得以“命门”穴为中心区附近0.5-1.5㎝内的皮下浅筋膜,另外,用咬骨钳沿椎弓根剪开,暴露出一条灰白圆柱状的脊髓。经冲洗、固定、脱水、浸蜡后,制得切片两张并进行染色。3、SP法观察ERK1/2和P38蛋白在浅筋膜及脊髓中的表达情况:按上述步骤制得切片后,利用免疫组化法(SP法)进行染色,并用Imageproplus6.0计算图像的平均光密度值(MD),再用GraphPadPrism6.0软件对测出的结果进行计算、得取P值,若P<0.05或P<0.01则有统计学意义。4、蛋白印迹法检测ERK1/2和P38蛋白在“命门”穴附近的肌肉中的含量表达:利用凯基全蛋白提取试剂盒提取各组“命门”穴区组织的蛋白并测量蛋白浓度,按蛋白变性、制胶、上样、截胶、转膜、封闭、显色等步骤得出五组灰色条带,经Alpha View SA软件测定条带灰度值,并利用One-Way ANOVA方差分析检测各组间是否有统计学意义。5、分别采用磷钼酸法、微量酶标法、微板法分别热敏灸14天前后的大鼠血清中磷、钙离子、碱性磷酸酶浓度进行测量。数据均以~_x±s表示,统计前进行正态分布检验和方差齐性检验,组间前后比较采用t检验,P<0.05有统计学意义。结果:1、经卵巢摘除后的大鼠阴道分泌物:连续五天正常组大鼠阴道分泌物涂片呈动情前期-动情期-动情后期、间期规律进行演变;其余组的大鼠则表现为混乱的不规则周期改变,多数停留在动情间期。2、染色结果:浅筋膜HE染色结果:骨质疏松症大鼠经热敏灸治疗4天镜下结果没有改变,随着时间增加至14天改变较为显著。经热力的作用导致胶原纤维被牵拉,成纤维细胞发生可逆性收缩,表现在单位面积内细胞密度较大,“命门”穴区的结缔组织显示胶原纤维排列整齐,呈波浪式传导。荧光染色后胶原纤维的变化:正常组,模型组的胶原纤维排部交错杂乱呈网状排列,而经热敏灸4天的大鼠的胶原纤维排列几乎没有任何改变,随着热敏灸时间延长至14天变化逐渐显著,胶原纤维在热敏灸作用下被拉伸牵引,张力增加总体呈向心性排布,即朝向“命门”穴附近。脊髓HE染色结果:对于中枢神经系统而言可促进运动神经元细胞的增殖及提高后角细胞对热刺激的敏感性,经热敏灸4天大鼠的脊髓较模型组无明显变化,热敏灸7天后前角处神经元细胞数量有所增加且体积增大,后角处神经胶质细胞数量增加,热敏灸14天后前角神经元细胞数目增加显著,细胞核较大而圆,核仁明显。3、SP法检测结果:浅筋膜SP法检测结果:“命门”穴附近的浅筋膜经SP法染色发现成纤维细胞和巨噬细胞周围包绕棕黄色反应带,五组ERK1/2和P38蛋白表达强弱关系为:模型组<正常组<热敏灸4天组<热敏灸7天组<热敏灸14天组。“命门”穴和“足三里”穴结果比较:经比较发现热敏灸“命门”穴对两个的蛋白的表达皆高于“足三里”穴,但两者对比不构成差异,即(P>0.05)。脊髓SP法观察结果:通过SP法染色发现ERK1/2蛋白的阳性反应多集中在脊髓前角的神经元细胞周围,而P38蛋白相比之下着色更浅。但二者均在热敏灸14天作用下效果最为突出,热敏灸4天组无统计学意义(P>0.05),整体体现的强弱关系为:模型组<热敏灸4天组<正常组<热敏灸7天组<热敏灸14天组。4、Western-Blot法检测结果:在热敏灸4、7、14天后大鼠“命门”穴附近的肌肉中ERK1/2和P38蛋白总体呈上升趋势,热敏灸4天组比较虽有所上升,但不具统计学意义(P>0.05),热敏灸14天后与正常组和模型组对照显然增加(P<0.01)。5、血清中磷、钙离子、碱性磷酸酶浓度测量结果:经热敏灸14天前后对比发现大鼠血清中的磷、碱性磷酸酶浓度有所上升(P<0.01),钙离子浓度小有减低(P<0.05)。结论:1、采用OVX可有效制得骨质疏松症模型,以观察阴道上皮细胞和白细胞的数量变化,以证明去势成功。2、热敏灸“命门”穴可引起患骨质疏松症大鼠的疏松结缔组织改变,经热力的作用导致胶原纤维被牵拉,可促进运动神经元细胞的增殖及提高后角细胞对热刺激的敏感性;就热敏灸时间而言,14天为最佳时间。3、热敏灸“命门”穴可提高浅筋膜及脊髓中的ERK1/2和P38蛋白表达情况来改善骨质疏松症;就时间而言,在一定时间内(14天)时间越长效果越明显。4、热敏灸“命门”穴在各时间段均可通过增加肌肉中ERK1/2和P38蛋白激酶激活MAPK信号通路来改善骨质疏松症,但以热敏灸14天为最优。5、热敏灸能降低血清中钙离子浓度,升高血磷和碱性磷酸酶,从而促进成骨细胞活性,抑制破骨细胞增殖,对骨的重建和愈合有重要意义。综上所述,热敏灸可以通过结缔组织形态学改变以及神经-体液调节来实现MAPK信号通路的传导,进而改善骨质疏松的症状,以热敏灸14天为理想时间。