乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一。为探讨OGFR在乳腺癌中的表达意义及OGF、OGFR相互作用在乳腺癌发生发展中的作用，本研究采用RT-PCR方法检测了正常乳腺、乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生及乳腺浸润性导管癌组织中OGFR mRNA的表达；采用Western Blotting和免疫组化技术检测了上述组织中OGFR蛋白的表达；采用免疫组化技术检测了上述组织中OGF蛋白的表达。通过细胞计数、MTT实验、细胞周期分析观察了OGF对人乳腺癌MCF-7细胞株生长的影响，并观察了OGF联合应用Taxol对人乳腺癌MCF-7细胞株的生长抑制作用。 第一部分 OGF、OGFR在乳腺癌中的表达研究 目的: 观察OGF、OGFR在乳腺病变中的表达规律，探讨OGF-OGFR与乳腺癌发生发展的关系。 方法: 1. 病例采集：18 例正常乳腺、12 例乳腺腺病、8 例乳腺导管上皮异型增生、24 例乳腺浸润性导管癌组织均为承德医学院附属医院外科术中冰冻送检及手术切除立即送检标本。 2. OGFRmRNART-PCR检测：采用RT-PCR方法检测OGFR mRNA在乳腺不同病变之间的表达差异。以每例OGFR与β-actin扩增产物条带光密度的比值作为OGFR mRNA的相对表达量。 3. OGFR在蛋白水平上的表达情况：采用western blotting和免疫组化方法检测OGFR蛋白在乳腺不同病变之间的表达。Western blotting检测以每例OGFR与β-actin条带光密度的比值作为OGFR蛋白的相对表达量，免疫组化检测以阳性率的形式表示OGFR蛋白的相对表达量。 4. OGF在蛋白水平上的表达情况：采用免疫组化方法检测乳腺不同病变之间OGF蛋白的表达，以阳性率的形式表示OGF蛋白的相对表达量。 结果: 1. OGFR在正常乳腺组织、乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生和乳腺癌中的表达变化 1.1 OGFR在mRNA水平上的表达情况: RT-PCR结果显示，正常乳腺组织、乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生和浸润性导管癌中的OGFR mRNA相对表达量分别为2.4000，1.0562，1.1451和0.6581。正常乳腺组织OGFR mRNA的表达明显高于乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生和浸润性导管癌(P<0.05)；乳腺导管上皮异型增生明显高于乳腺浸润性导管癌(P<0.05)。OGFR mRNA在乳腺浸润性导管癌中的表达与患者年龄、肿瘤体积、组织学分级、雌孕激素受体表达、C-erbB-2表达及淋巴结转移无关(P>0.05)。 1.2 OGFR在蛋白水平上的表达情况: 1.2.1 Western blot检测发现，正常乳腺组织中OGFR蛋白表达量为3.0957，明显高于乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生和浸润性导管癌中(分别为2.0632，1.7928和1.1128，P<0.05)；乳腺腺病OGFR蛋白表达量明显高于浸润性导管癌(P<0.05)。 1.2.2 免疫组化检测发现，OGFR染色阳性物质位于细胞质与细胞核，OGFR的阳性染色在正常乳腺、乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生的腺上皮与肌上皮及癌细胞中均可见到。正常乳腺组织、乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生和浸润性导管癌中的OGFR蛋白表达阳性率分别为68.80％，44.22％，40.00％和25.52％。正常乳腺组织中明显高于乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生和浸润性导管癌中(P<0.01)；乳腺腺病和乳腺导管上皮异型增生中明显高于乳腺癌中(P<0.01)。 2. OGF在正常乳腺组织、乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生和乳腺癌中的表达变化 免疫组化检测发现，OGF染色阳性物质位于细胞质，OGF阳性染色在正常乳腺、乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生的腺上皮与肌上皮及癌细胞中均可见到。浸润性导管癌组织中OGF的表达阳性率为13.29％，明显低于正常乳腺组织、乳腺腺病和乳腺导管上皮异型增生(55.43％、43.48％和34.50％，P<0.01)；在乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生中明显高于乳腺癌中(P<0.01)。 结论: 1. 正常乳腺组织、乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生和乳腺癌组织中均可以检测到OGFR mRNA和蛋白及OGF蛋白的表达。 2. 从正常乳腺组织、乳腺腺病、乳腺导管上皮异型增生到乳腺癌组织中OGF及OGFR表达均呈逐渐下降的趋势，提示OGF和OGFR可能与乳腺癌的发生发展有关。 3. OGFR在mRNA和蛋白水平的表达降低可以作为乳腺癌的标志。 第二部分阿片生长因子抑制乳腺癌细胞生长的实验研究 目的: 探讨OGF对人乳腺癌细胞株MCF-7体外生长及OGFR拮抗剂naloxone对OGF作用的影响。 方法: 1. 免疫组化方法检测MCF-7细胞中OGF-OGFR的表达 将对数生长期的细胞用胰酶消化后制成细胞悬液，调细胞密度在4～5×105/ml，滴加200μl细胞悬液于载玻片上，培养皿中37℃培养24h；丙酮固定后，免疫组化S-P法检测OGF-OGFR的表达。 2. OGF于体外实验中最佳抑瘤浓度的确定 取对数生长期的细胞，将细胞消化后制成细胞悬液，按2×103/孔接种入96孔板，分为10-4、10-5、10-6、10-7M组及空白对照组，每组5个复孔，每孔加入培养基200μl；每24h更换培养基并每孔分别加入2μl OGF，使各种成分保持上述浓度，空白对照组加入0.9％盐水2μl；采用MTT法检测加药后24h、48h、72h、96h吸光度(OD)值，并计算细胞增殖抑制率，选择最适用药浓度。 3. OGF对MCF-7细胞生长的抑制作用 结论: 1. 免疫组化检测结果表明，MCF-7细胞中存在着OGF与OGFR蛋白的表达。 2. 10-4、10-5和10-6的OGF均能抑制MCF-7细胞生长，10-6M可以作为OGF体外实验中抑制MCF-7细胞生长的最适实验浓度。 3. OGF于体外实验中能显著抑制MCF-7细胞生长，而naloxone能阻断其生长抑制作用。 第三部分阿片生长因子联合紫杉醇抑制乳腺癌细胞生长的实验研究 目的: 探讨OGF联合Taxol对MCF-7人乳腺癌细胞生长的抑制作用，进一步观察应用OGFR拮抗剂naloxone后，OGF及Taxol对细胞生长的差别，探讨其作用机制。并通过可逆性实验，比较OGF和Taxol的细胞毒性。 方法: 1. OGF联合Taxol于体外实验中对乳腺癌细胞生长的影响 将对数生长期的细胞消化后制成细胞悬液，按2×103/孔接种入96孔板，每孔含培养基200μl。分为OGF处理组、Taxol处理组、OGF联合Taxol处理组及空白对照组，每组5个复孔。OGF处理浓度为10-6M、Taxol为10-7 M。分别于接种细胞后24h、48h、72h、96h更换培养基并每孔分别加入2μl OGF、Taxol、OGF和Taxol，使各种成分保持上述浓度，空白对照组加入0.9％盐水2μl。采用MTT法检测加药后24h、48h、72h、96hOD值，并计算细胞增殖抑制率。 2. OGFR拮抗剂naloxone及Taxol对OGF于体外实验中作用于MCF-7细胞产生的影响 将对数生长期的细胞消化后制成细胞悬液，按2×103/孔接种入96孔板，每孔含培养基200μl。分为naloxone处理组、OGF处理组、OGF/naloxone处理组、Taxol处理组、OGF/Taxol处理组、Taxol/naloxone处理组、OGF/Taxol/naloxone处理组及空白对照组，每组5个复孔。OGF、naloxone处理浓度为10-6M、Taxol为10-7M。分别于接种细胞后24h、48h、72h、96h更换培养基并每孔分别加入OGF、Taxol、OGF/Taxol、naloxone、OGF/naloxone、Taxol/naloxone、OGF/Taxol/naloxone各2μl，使Taxol保持10-7M，其余各种成分保持10-6M，空白对照组加入0.9％盐水2μl。采用MTT法检测加药后96h的OD值，并计算细胞增殖抑制率； 3. OGF于体外实验中对乳腺癌细胞生长的可逆性影响 结论: 1. OGF与Taxol联合应用对乳腺癌MCF-7细胞具有增强的生长抑制作用，作用效果大于单一成分的作用； 2. naloxone可以阻断OGF对MCF-7细胞生长的作用，但不能阻断Taxol的作用，OGF对MCF-7细胞生长的影响是受体(OGFR)介导的，而Taxol的作用无OGFR介导； 3. OGF没有细胞毒性，能对MCF-7细胞增殖发挥可逆性的影响，Taxol具有细胞毒性，不能对MCF-7细胞增殖发挥可逆性的影响。