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本文主要从以下几方面进行了论述: 第一部分 目的:研究不同浓度不同作用时间下胰岛素对酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(Acyl-CoA: cholesterol acyltransferases1,ACAT1)mRNA和蛋白表达的影响。 方法:体外培养THP-1细胞,诱导分化为巨噬细胞,给予不同浓度(0,10,100,1000nM)不同作用时间(0,4,12,24h)的胰岛素分组干预,实时定量PCR、Western blot检测巨噬细胞ACAT1mRNA和蛋白表达。 结果:胰岛素浓度为100nM时ACAT1表达增加(P<0.05),胰岛素浓度为1000nM时ACAT1表达显著增加(P<0.01)。随胰岛素浓度增加,ACAT1mRNA和蛋白表达水平上升。胰岛素作用4h后,ACAT1表达无明显变化,12小时后ACAT1mRNA和蛋白表达水平增加(P<0.05),而作用24小时后ACAT1表达有所下降,且与12小时比较有统计学差异。 结论:胰岛素上调ACAT1mRNA和蛋白表达,且呈时间和剂量依耐性。 第二部分 目的:研究胰岛素上调ACAT1所涉及的信号转导途径。 方法:体外培养THP-1细胞,诱导分化为巨噬细胞,采用胰岛素和信号途径抑制剂(包括:PI3K抑制剂wortmannin;ERK抑制剂PD98059;p38MAPK抑制剂 SB203580;JNK抑制剂SP600125;PLC-γ抑制剂U73122)分组干预,实时定量PCR、Western blot检测巨噬细胞ACAT1基因、蛋白表达。 结果:PD98059,SB203580,SP600125干预组与胰岛素组比较ACAT1mRNA与蛋白水平均降低,而wortmannin和U73122干预组与胰岛素组相比ACAT1mRNA和蛋白水平无明显变化。 结论:ERK/p38MAPK/JNK信号途径参与胰岛素介导的巨噬细胞ACAT1上调。 第三部分 目的:研究过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator activated receptors-γ,PPAR-γ)配体罗格列酮在高胰岛素环境下对巨噬细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1表达的影响。 方法:在RPMI1640培养基中培养人单核细胞系(THP-1),加入佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)培养48h,细胞贴壁呈巨噬细胞样分化。将细胞分组为:高胰岛素对照组和不同浓度罗格列酮组(10μmol/L,15μmol/L,20μmol/L),运用实时定量PCR和Western Blot,观察巨噬细胞ACAT1mRNA和蛋白表达水平的变化。 结果:以高胰岛素处理的巨噬细胞为对照组,加入罗格列酮后ACAT1mRNA的表达明显降低,且随浓度升高,降低更显著(R1:R2:R3:R4=1:0.63:0.24:0.14),组间有显著差异。ACAT1蛋白表达均较对照组降低(R2 P<0.05,R3、R4 P<0.01),且呈罗格列酮浓度依赖性。 结论:PPAR-γ配体罗格列酮呈浓度依赖性抑制ACAT1表达发挥其抗动脉粥样硬化的作用。 第四部分 目的:研究过氧化物酶体增殖物激活受体-γ在高胰岛素状态下对巨噬细胞中酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1表达影响的机制。 方法:在RPMI1640培养基中培养人单核细胞(THP-1),加入佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)培养48h,细胞贴壁呈巨噬细胞样分化。在高浓度胰岛素状态下,加入PPAR-γ的配体罗格列酮和胰岛素信号途径阻滞剂,包括ERK抑制剂PD98059、p38MAPK抑制剂SB203580和JNK抑制剂SP600125,运用实时定量聚合酶链反应、蛋白质免疫印迹,观察巨噬细胞ACAT1表达水平的变化。 结果:在高胰岛素状态下,加入罗格列酮后ACAT1mRNA水平较前明显降低(P<0.05),ACAT1蛋白表达较前也显著下降(P<0.01),再加入p38MAPK抑制剂SB203580后ACAT1 mRNA水平和蛋白表达较罗格列酮组均增加(P<0.01),而ERK抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP600125使ACAT1表达与罗格列酮组比较无统计学差异(P>0.05)。 结论:p38MAPK途径参与PPAR-γ抑制ACAT1的表达,发挥其抗动脉粥样硬化的作用。