[目的]体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(BMSCs);体外低氧培养兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),探讨低氧微环境对兔BMSCs在体外培养、增殖及成骨分化的影响。[方法]抽取健康新西兰大白兔骨髓,使用贴璧法分离及纯化骨髓间充质干细胞,根据骨髓间充质干细胞在培养瓶中可以贴壁生长的特性,我们通过定期换液从而达到纯化骨髓间充质干细胞。取第3代细胞,使用免疫组化检测贴壁细胞的表面标记物CD44,从而初步证实分离的细胞为BMSCs。观察原代细胞及传代细胞的形态特征、生长状况。使用全骨髓贴壁分离法,换液及传代得到的BMSCs,取第3代细胞,根据培养氧浓度及培养基类型分为4组:正常氧常规培养组(20%02加Dulbecco改良的伊格尔培养基/F12)、低氧常规培养组(1%02加Dulbecco改良的伊格尔培养基/F12)、正常氧成骨诱导组(20%502加成骨诱导培养基)及低氧成骨诱导组(1%O2加成骨诱导培养基),通过细胞计数、细胞增殖测定、增殖细胞核抗原检测,观察低氧对BMSCs增殖凋亡的影响;碱性磷酸酶活性检测及Gomori钙钴染色,研究低氧环境对BMSCs成骨分化的影响。[结果]分离的原代细胞48h后可见少量贴壁生长的现象,约96h后可见分离细胞呈放射状排列,增殖呈集落样。免疫组化检测贴壁细胞的CD44,我们发现细胞表面标志表达与间充质干细胞的特征一致,证明培养的细胞为骨髓间充质干细胞。将骨髓间充质干细胞放入成骨诱导培养基进行培养后,可以观察到细胞生长会出现一天至两天的一个较长的生长平台期,虽然此时的细胞生长缓慢,但是在这个生长平台期内细胞形态大多会发生改变,体积也慢慢变大;之后我们对细胞进行胰酶消化及连续的传代培养,我们发现传代到第3代时,细胞会经过一个长约1到2天的潜伏期;在将近第7到8天左右时,细胞生长开始呈对数生长,后我们发现细胞生长仍会过渡到平台期。分离的细胞在标准培养基DMEM/F12中培养后结果显示:与正常氧组相比,低氧组中的BMSCs细胞数量明显增加;PCNA染色细胞增多,有较高的增殖速度;TUNEL阳性率明显低于正常氧组,抑制BMSCs凋亡;两者生长差异显著(P<0.05);分别在四组中进行细胞的连续培养,结果发现,在低氧成骨培养基中所培养的细胞的碱性磷酸酶的活性,与在正常氧成骨诱导培养基中所培养的细胞相比,其碱性磷酸酶活性明显增高,经统计学分析,结果显示两者有明显的差异(P<0.01);把分离纯化及传代培养的细胞放入成骨诱导培养基中进行连续培养14天,结果显示细胞的碱性磷酸酶染色呈阳性。连续培养4周后,结果显示正常氧成骨诱导组的碱性磷酸酶染色可以观察到有较多的钙盐沉积以及棕黑色的钙结节,而其它三组表现不明显。[结论]实验中经过分离纯化所获得的细胞为骨髓间充质干细胞。低氧使体外培养的BMSCs增殖率增加,抑制成骨细胞分化,保持干细胞特征。