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以庆大霉素Cla这一条代谢支路为主线,阻断gmrB、gmrA和sisI三个基因的表达,成功构建GenB102、GenA102和TI102三株工程菌。同时,借助统计学理论,对主产庆大霉素C1a的菌株GbK10发酵条件进行优化,并进行产业化验证。1,工程菌GenB102的构建及gmrB基因功能研究。用质粒pKC1139为分子克隆的基本载体,构建同源重组质粒pKBE2,用于灭活gmrB基因。重组质粒通过接合转移导入绛红色小单孢菌G1008基因簇中,通过抗性筛选得到单交换菌株GenB101,经松弛培养后,筛选获得gmrB基因缺失工程菌GenB102。利用TLC和MS法对工程菌代谢产物进行分析,结果显示,与G1008类似,GenB102仍合成庆大霉素C组分,表明gmrB基因不是修饰绛红糖胺C-6’位N甲基化酶基因,可能是辅助抗性基因。2,工程菌GenA102的构建及gmrA基因功能研究。采用类似于(1)的研究方法,获得gmrA基因失活工程菌GenA102。代谢产物经TLC和MS分析,结果显示,工程菌GenA102主要积累离子峰为511.3、525.3和539.3的产物,与亲株的450.3、464.3和478.3不同,说明gmrA基因可能参与庆大霉素生物合成过程,但不是绛红糖胺C-6’位N甲基化酶基因。对工程菌生长特性进行考察,发现GenA102在庆大霉素浓度为50 u/mL时便不能生长。通过对gmrA基因进行克隆与体外表达,结果表明,整合有gmrA基因的大肠杆菌DA2抗庆大霉素浓度高达1000 u/mL以上,证明gmrA是绛红色小单孢菌关键抗性基因。3,主产JI-20A工程菌的构建。以pKC1139为载体,构建同源重组质粒pKTI2,在依纽小单孢菌TS388上敲除sisI基因,获得sisI基因缺失工程菌TI102。其代谢产物经TLC和MS检测分析,结果显示,TI102不再合成西索米星,只生成中间体JI-20A,表明sisI基因负责参与催化绛红糖胺3’,4’-双脱羟基反应,同时获得一株主产JI-20A的工程菌。4,genP与sisI基因功能同一性研究。构建genP基因替换依纽小单孢菌TS388中sisI基因的重组工程菌TPI102,其代谢产物经TLC及MS分析。结果表明,工程菌不积累JI-20A,主要积累西索米星,与亲株一致,说明genP基因可在依纽小单孢菌中异源表达,从而不仅再次验证了sisI和genP基因均是负责绛红糖胺3’,4’-双脱羟基的酶基因,也揭示了小单孢菌之间基因组合的可行性。5,GbK10发酵优化及产业化试验。以绛红色小单孢菌GbK10为出发菌株,通过Plackett-Burman设计方法选出对GbK10发酵单位影响显著的四个因子,采用RSM响应面法,对这四个显著因子的交互效应进行研究,并计算出培养基的优化组合:玉米淀粉59.8 g/L,黄豆饼粉28 g/L,起始pH 7.17,转速264 rpm,使得GbK10摇瓶发酵单位从520 u/mL提高到767.9 u/mL。对GbK10进行产业化扩大验证,在200 L发酵罐中发酵单位可达972.3 u/mL,35 t发酵罐中发酵单位则上升到1100.8 u/mL,已达到产业化需求。