【摘 要】
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葡萄（Vitis spp.）是全球重要的经济类果树类作物之一。冬季冻害、春季‘倒春寒’寒害频发,严重制约了我国葡萄与葡萄酒产业的健康可持续性发展,并造成严重的经济损失。因此,解析葡萄属植物应答低温胁迫的生物学机制与调控途径,挖掘葡萄重要农艺性状候选基因资源,对于葡萄抗寒分子育种具有重要的理论意义与实践价值。本研究基于课题组前期研究发现,验证了山葡萄转录因子VaMYB4a为低温正调控因子VaCIPK
【基金项目】
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国家地区自然科学基金项目“山葡萄VaCIPK18介导VaMYB4a磷酸化调控抗寒应答的分子机理”（资助号:3206180215）；
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葡萄（Vitis spp.）是全球重要的经济类果树类作物之一。冬季冻害、春季‘倒春寒’寒害频发,严重制约了我国葡萄与葡萄酒产业的健康可持续性发展,并造成严重的经济损失。因此,解析葡萄属植物应答低温胁迫的生物学机制与调控途径,挖掘葡萄重要农艺性状候选基因资源,对于葡萄抗寒分子育种具有重要的理论意义与实践价值。本研究基于课题组前期研究发现,验证了山葡萄转录因子VaMYB4a为低温正调控因子VaCIPK18的潜在互作组分;解析了VaMYB4a参与低温胁迫的功能特点,进一步通过酵母双杂交、ChIP-seq技术挖掘其低温信号传递网络中的下游关键组分。研究结果为揭示该转录因子参与葡萄抗寒机理和采用遗传改良手段培育抗寒葡萄新品种（系）提供了参考。主要结果如下:1、山葡萄VaMYB4a与VaCIPK18存在蛋白互作关系通过酵母双杂交、双分子荧光互补以及Co-IP确定了山葡萄VaMYB4a可与VaCIPK18在体内与体外存在互作关系,VaMYB4a为VaCIPK18潜在的磷酸化底物;2、VaMYB4a正调控植物应答低温胁迫低温胁迫诱导VaMYB4a表达、形成同源二聚体,并伴随着翻译后修饰现象;VaMYB4a在酵母中过表达增强了低温耐受性;在-5℃低温处理下,VaMYB4a过表达拟南芥的存活率显著高于野生型拟南芥;VaMYB4a过表达拟南芥的细胞膜完整性、可溶性糖含量、抗氧化酶（SOD、POD）活性均高于野生型拟南芥;VaMYB4a过表达拟南芥对ABA超敏感,并引发气孔关闭;VaMYB4a通过依赖或不依赖CBF信号途径;同时,调控ABA信号途径中的关键基因的表达,从而正调控植物应答低温胁迫。3、VaMYB4a 与下游蛋白 VaCOL2、VaCOL4、VaCOL5 互作构建了山葡萄低温诱导酵母双杂交均一化cDNA文库,以VaMYB4a C端调控区段（113～252 aa）为诱饵,酵母双杂交筛选获得了 18个VaMYB4a潜在候选互作蛋白;验证了VaCOL2、VaCOL4、VaCOL5均与VaMYB4a全长及VaMYB4a C端调控区段存在互作关系。4、VaMYB4a与其下游靶基因VaPIF3互作通过ChIP-seq试验,从葡萄全基因组中筛选出VaMYB4a下游候选靶基因VaPIF3。经酵母单杂交、双杂交及双分子荧光互补技术验证发现VaMYB4a不仅可以与VaPIF3在蛋白层面发生互作,还可以直接结合在VaPIF3基因启动子481～529 bp、1856～2021 bp及2459～2529 bp区段上的CTTC基序结合。5、VaMYB4a-VaPIF3-VaCBF4分子模块参与低温胁迫应答通过酵母单杂交、双杂交验证发现VaPIF3可与VaCBF4在基因、蛋白水平互作;在酵母、拟南芥中验证发现VaMYB4a可与VaCBF4互作;从而建立了 VaMYB4a-VaPIF3-VaCBF4分子模块参与低温胁迫应答的网络。
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