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蜜蜂通过授粉服务不仅促进农业生产的发展,对维持生态系统平衡同样发挥重要作用。然而,近年来蜜蜂在生物因素和非生物因素胁迫下数量骤减,引发全球关注。其中,新烟碱类杀虫剂的广泛使用被认为是促使蜜蜂数量减少的因素之一。吡虫啉(imidaclorprid)是新烟碱类农药中使用最为广泛的农药种类,作用于蜜蜂脑部的烟碱型乙酰胆碱受体,引起蜜蜂嗅觉学习缺陷。本研究通过转录组学分析筛选相关功能基因,并利用qRT-PCR对功能基因进行时空表达分析,同时针对mrjp1对蜜蜂学习记忆行为的调控作用,采用RNAi技术进行基因功能验证。首次从分子机制角度探析吡虫啉亚致死剂量对蜜蜂学习行为的影响,获得的主要研究结果如下:1.本文选取蜜蜂在现实采集环境中可能接触到的吡虫啉剂量(20 ppb),研究吡虫啉亚致死剂量对相同日龄蜜蜂学习行为的影响。蜜蜂在接触20 ppb吡虫啉长达11 d后,利用学习设备对蜜蜂进行气味联想性学习实验。结果表明,20 ppb吡虫啉虽对蜜蜂无致死毒性,但却使蜜蜂在第二次和第三次学习中喙伸反应率极显著降低(P<0.01),即蜜蜂受吡虫啉胁迫后学习能力降低。2.利用RNA-Seq对吡虫啉处理后的蜜蜂和对照组蜜蜂的脑部进行比较转录组分析,评估吡虫啉对蜜蜂学习能力的影响。吡虫啉处理组和对照组的基因表达谱显示有131个基因差异表达(padj<0.05),其中有130个基因在吡虫啉处理组蜜蜂中下调表达。脑部下调基因主要涉及免疫基因、解毒基因以及抗氧化反应基因。GO富集表明长期接触吡虫啉引起的氧化应激可能导致蜜蜂脑部氧化还原反应失衡。KEGG通路富集表明吡虫啉处理组蜜蜂中光传导通路中transient receptor potential和Arrestin 2显著下调表达,IPA分析表明5个下调基因也可能参与调控蜜蜂的嗅觉学习行为。3.运用qRT-PCR对功能基因进行时空表达分析发现qRT-PCR和RNA-Seq的结果具有较高的一致性,证明测序结果具有可靠性,并且其中有20个基因在处理组蜜蜂中显著下调(P<0.05或P<0.01)。进一步表明吡虫啉亚致死剂量通过下调蜜蜂脑部的免疫、解毒和化学感受器相关基因的表达,导致蜜蜂受吡虫啉胁迫后表现出差强人意的嗅觉学习能力。4.转录组学分析表明major royal jelly protein 1(mrjp1)在吡虫啉处理组蜜蜂脑中显著下调。mrjp1在蜜蜂触角叶、视叶和蕈形体中均有表达,采用RNAi技术将mrjp1基因特异性沉默进一步验证mrjp1在蜜蜂嗅觉学习行为中的关键作用。结果表明,ds-mrjp1组与ds-egfp组学习行为差异显著(P<0.05),ds-mrjp1组蜜蜂的学习能力降低,但两组蜜蜂的2 h记忆无显著差异(P>0.05)。qRT-PCR结果同样表明学习能力降低的实验组对应的mrjp1表达水平也降低(P<0.05),进一步表明mrjp1基因调控蜜蜂学习行为。