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目的:免疫治疗是目前除了传统手术切除、放化疗及靶向药物治疗外,最具有发展潜力的新兴肿瘤治疗手段。免疫细胞传输治疗是免疫治疗的主要手段之一,虽然在血液系统恶性肿瘤中的运用达到了较好的治疗效果,但其在实体肿瘤中的临床应答率却不尽人意。实体肿瘤微环境中大量存在的免疫抑制因子,如活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)堆积导致的氧化应激环境可造成免疫细胞的浸润减少及功能损伤。自然杀伤(Natural Killer,NK)细胞作为固有淋巴细胞,对病毒感染的细胞及肿瘤细胞可起到早期识别和杀伤作用。细胞因子白介素15(Interleukin-15,IL-15)则可促进在NK细胞的增殖和活化。本研究旨在探究IL-15对自然杀伤细胞在肿瘤氧化应激微环境中耐受能力的影响及其相关分子机制,并进一步对NK细胞浸润和IL-15表达在非小细胞肺癌患者队列中进行了预后价值分析,从而为NK细胞免疫治疗在非小细胞肺癌中的应用提供了新的研究思路和治疗策略。方法:1.外周血来源的NK细胞分别利用IL-2和IL-15激活,经靶细胞K562细胞刺激后,利用Cr-51释放实验检测其毒性杀伤能力;通过检测NK细胞的CD107a和胞内干扰素γ(Interferon,IFNγ)含量对比其细胞因子分泌功能。进一步通过比对过氧化氢处理前后的Cr-51释放实验结果,NK细胞CD 107a、胞内IFNγ及ROS含量情况,来评估IL-2和IL-15激活后的NK细胞对活性氧的耐受能力。2.为探究IL-15影响NK细胞氧化应激耐受能力的具体机制,对NK细胞基因测序结果进行相关基因功能集富集分析。通过q PCR、Western Blot、流式细胞检测和免疫荧光技术等验证硫氧还蛋白系统相关蛋白在IL-15激活NK细胞中的改变;利用Maleimide标记对比两种细胞因子激活后的NK细胞表面硫醇含量变化及其影响;并进一步通过PX-12和Torin-1分别抑制Trx和m TOR来验证硫氧还蛋白系统对NK细胞氧化应激耐受能力的影响。3.收集非小细胞肺癌患者的癌组织、癌旁组织及正常肺组织标本,对比分析非小细胞肺癌组织中的氧化应激环境、NK细胞浸润比例及NK细胞表面硫醇表达水平的关系;对比公共数据库中的肺癌组织和配对外周血的单基因测序结果分析肿瘤浸润NK细胞的氧化还原相关基因的变化;通过分析对比TCGA-LUAD数据库中的吸烟与非吸烟患者的预后情况,探究NK细胞基因标签与IL15基因表型对非小细胞肺癌的预后预测价值。结果:1.IL-15激活的NK细胞的肿瘤毒性杀伤能力显著增强,且其CD107a和IFNγ含量也相对于IL-2激活的NK细胞显著升高。经不同浓度过氧化氢处理后,IL-15激活的NK细胞较IL-2仍可以维持较高水平的CD107a和IFNγ含量及肿瘤杀伤效率,且其细胞的胞内ROS水平显著低于IL-2激活后的NK细胞。2.基因富集结果显示IL-15可以激活NK细胞的氧化还原酶系统,主要为硫氧还蛋白系统;q PCR、Western Blot及免疫荧光染色结果提示IL-15可增加NK细胞的Trx表达并减少TXNIP的核外转移;Maleimide标记显示IL-15激活的NK细胞高表达表面硫醇,而抑制Trx-1可以减少NK细胞表面硫醇、降低IL-15激活NK细胞对氧化应激的耐受能力;Torin-1抑制试验提示m TOR可通过抑制TXNIP来维持硫氧还蛋白活性和细胞表面硫醇。3.流式检测分析肺癌不同部位组织标本提示肿瘤内部的氧化应激环境可减少NK细胞的浸润,而高表达的表面硫醇可协助NK细胞浸润至肿瘤内部;单基因测序结果提示非小细胞肺癌中肿瘤浸润NK细胞氧化还原相关基因表达增高;通过对非小细胞肺癌患者的相关生存曲线的分析,我们发现在具有吸烟史的患者中,高NK细胞浸润和高IL-15表达可提示更好的预后。结论:细胞因子IL-15可通过激活硫氧还蛋白系统来增强肿瘤微环境中NK细胞对氧化应激的耐受能力,为NK细胞免疫治疗在非小细胞肺癌中的研究和临床转化提供了新的研究方向和潜在治疗策略。