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维生素D3（Vitamin D3,VD3）作为重要的激素前体,它是人类、动物生长和繁殖必不可少的一种物质。VD3其母核结构中的C1α位或C25位若发生羟基化作用,可以形成具有生理活性的VD3,具有调节体内钙磷平衡、提高免疫力、诱导细胞增殖分化等特点,具有很大的应用价值。随着人类对活性VD3日益增多的需求,以及利用化学合成法生产活性VD3存在合成步骤多、产率低、成本高、环境污染严重等缺点,不适合于大规模工业化生产。因此目前国内外学者都把注意力转向利用微生物转化法来生产活性VD3,该方法具有反应条件温和、环境污染少、高度立体选择性等优点,利用选择性羟化酶实现活性VD3的生物转化具有更广泛的应用前景。因此,本研究通过利用基因工程手段,选择具有将VD3羟基化功能的酶基因CYP10A1和与其兼容性较好的来自不动杆菌中的电子传递链基因（即铁氧还蛋白/还原酶Fdx-Fdr）在大肠杆菌中实现异源表达。通过构建一菌多酶体系,进行全细胞催化实验,克服胞内酶的不稳定性难题,提高催化VD3进行羟基化反应的效率,为合成具有生理活性的VD3奠定基础。主要研究内容如下:（1）在本论文中,成功构建了含有羟化酶基因CYP10A1及电子传递链基因Fdx-Fdr的工程菌,且三个关键酶CYP10A1、Fdx和Fdr均实现了活性表达。（2）对三个活性表达的关键酶进行分离纯化。用DCPIP考察了Fdr的活性,验证了Fdr能够接收辅酶NAD（P）H传来的电子;利用细胞色素C考察了Fdr与Fdx偶联性,Fdx能够与Fdr进行偶联,将辅酶NADH的电子通过电子传递链传递给Fdx;而电子传递链（Fdx/Fdr）对于辅酶的选择更偏好于辅酶NADH。（3）确定了VD3及其羟化产物的检测方法,且成功建立了催化VD3的羟基化反应体系,验证了CYP10A1具有羟基化功能,与电子传递链Fdx-Fdr联合作用能够对底物VD3进行羟基化,从而合成具有生理活性的VD3。（4）成功构建了同时包含羟化酶基因CYP10A1和电子传递链基因Fdx-Fdr的基因工程菌,建立一个一菌多酶反应体系,且三个目的蛋白酶均实现了可溶性表达,验证了构建成功的工程菌可以催化底物VD3进行羟基化作用,合成具有生理活性的VD3,为直接利用基因工程菌进行全细胞催化合成具有生理活性的VD3奠定了基础。（5）在一菌多酶体系中,进行全细胞催化VD3实验,探索助溶剂、辅酶、生物催化剂负载（即重组细胞的浓度）对其羟基化效率的影响,为实现合成具有生理活性的VD3的工业化生产提供依据。研究结果表明:助溶剂DMSO可以在一定程度上促进VD3的羟基化作用,当添加量为1%时,两种活性产物的产量达到1.581 mg/L、0.348 mg/L。其次,辅酶NADH的添加对VD3的羟基化作用有一定影响。添加量为1mM时,中间产物25（OH）VD3的产量达到1.660 mg/L,最终产物1α,25（OH）2VD3的产量为0.492 mg/L。故而在催化VD3合成具有生理活性的VD3的过程中保证足够的NADH是非常重要的。而重组细胞作为生物催化剂,最适宜的添加量为35 g/L,此时25（OH）VD3的产量达到最高,1α,25（OH）2VD3的产量也很高,分别为2.491 mg/L、0.698 mg/L。