论文部分内容阅读
棉花(GossypiumhirsutumL.)是世界上最重要的经济作物,棉铃虫(Helicoverpaarmigera)是影响棉花生产的主要害虫。为了有效地控制棉铃虫的危害、丰富防治策略,本研究采用RNA干扰技术,通过阻断棉铃虫激素相关基因的表达,以达到抗虫的目的。 首先,通过对昆虫激素的合成途径进行分析,确定了相关的关键基因。参照已知序列,采用PCR和RACE技术克隆了棉铃虫激素相关基因:保幼激素甲基转移酶基因(JuvenileHormoneAcidMethylTransferase,HaJHAMT)、促前胸腺激素基因(ProthoracicotropicHormone,HaPTTH)、保幼激素结合蛋白基因(JuvenileHormoneBindingProteins,HaJHBP),以及类胰蛋白酶基因(TrypsinLikeProtease,HaTLP),同时对这些基因在昆虫体内的表达模式进行了研究。 针对上述基因构建了一组E.colidsRNA表达载体,使用E.coli表达的dsRNA进行抗虫性检测,结果表明dsRNA对棉铃虫有明显的杀虫效果,其中HaJHAMT基因两个片段的dsRNA校正死亡率为46.4%和21.3%,HaPTTH基因为25.1%和25.5%,HaTLP基因为32.8%,HaJHBP基因为25.7%。随后,利用Bac-to-Bac系统构建了一组可表达发夹dsRNA结构的重组棉铃虫杆状病毒。生物测定结果表明,其中重组病毒HaBac△egtdsHaJHBP和HaBac△egtdsHaJHAMT对棉铃虫的半致死浓度(LC50)仅为对照组的27.8%和15.3%,HaBac△egtdsHaJHBP的半致死时间(ST50)缩短为对照组的57.6%,抗虫活性力有明显提高。实时定量PCR检测结果表明,棉铃虫在感染重组病毒后,靶基因表达受到了不同程度的抑制。其中HaJHBP基因和HaJHAMT基因的表达水平仅为对照的14.4%和58.9%,并下调了蜕皮激素受体编码基因EcR的表达。 进一步构建了相应的dsRNA植物表达载体,经遗传转化获得转基因烟草。抗虫性检测结果表明,其中HaTLP、HaJHBP和HaPTTH较好。取食转基因抗虫烟草叶片的棉铃虫校正死亡率最高可达68.7%,生物总重仅为对照组的33.9%,同时对烟草叶片的危害明显降低。检测结果表明,棉铃虫取食转基因烟草后体内靶基因表达受到了强烈抑制,仅为对照组的19.6~42.0%。同时还开展了棉花的遗传转化,转基因棉花初步的抗虫结果与烟草一致,目前已筛选到中高抗棉铃虫水平的转基因棉花株系。 本研究开创了通过干扰昆虫激素相关基因表达的抗虫策略,开发出的重组病毒,和新型转基因抗虫棉均具有实际应用的潜力,后者有可能成为Bt棉之后的抗虫棉培育新策略或替代方案,同时本研究的成果为其它作物害虫的治理提供了借鉴。