许多疾病在分子层面表现出的紊乱是相似的,只是由于表现在不同的细胞、组织中,由此产生不一样的病理特征。基于这一理论,近年来很多疾病领域都开始学习和应用“一药多用”这一理念。一药多用是指将已被广泛认识的药物跨疾病应用,从而开发其新的药物用途。一药多用的理念能够大大缩短药物安全性测试时间,降低研究成本,由此给广大患者带来福音。骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是最普遍的退行性疾病之一,尽管在数十年前就有着大量的研究报道,OA的治疗手段始终存在着一些局限性,尤其是其药物疗法只是针对OA带来的炎症反应,而非对软骨组织的修复。综合以上问题,本课题基于“一药多用”理念,选用了抗炎药、心血管疾病药物、抗微生物药物以及抗肿瘤药物在内的80种药物,希望通过一药多用的理念对药物进行广泛的筛选,得到治疗OA最有潜力的药物,并结合细胞信号通路相关研究尝试阐明药物作用的潜在机制和靶点。目的:应用一药多用理念广泛筛选各类药物,得到对OA体外模型具有保护作用的药物;结合信号通路相关内容,以OA生物标志物为靶点,研究筛选所得药物的潜在作用机制。方法:使用终浓度为10 n M的白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)与肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)联用刺激人源软骨胶质瘤细胞OUMS27建立骨性关节炎体外模型;通过文献阅读选取80种药物,光镜观察给药后24小时之内OUMS27的形态变化,将具有细胞毒性的药物筛除;用MTT法检测候选药物中能够缓解模型组细胞损伤的药物;造模后6、12、24、48、72小时用蛋白免疫印迹法检测OA关键蛋白,选取靶点;qRT-PCR检测先前筛选出的药物对靶蛋白表达的影响;蛋白免疫印迹法检测三条经典通路活化/磷酸化程度,用不同浓度抑制剂检测通路对靶蛋白mRNA水平的调节;使用50μM JAK、p90的抑制剂peficitnib、BI-D1870进一步检测调控靶蛋白的通路上下游。结果:1.光镜下观察加入候选药物的细胞状态,将其分为5个等级,从细胞形态饱满到呈球状死亡,状态依次恶化。用IL-1β与TNF-α刺激的模型组处于等级III;为了确保在测定剂量下药物的安全性,细胞状态在24小时内处于非等级I的给药组被筛除,剩余17种药物;MTT细胞活性检测法测定17种药物是否能够改善骨性关节炎体外模型,发现其中吲哚美辛、α-葡糖基芦丁、吡喹酮和阿司匹林显著增强了细胞活性(P<0.001)。2.用蛋白免疫印迹法检测在OA模型中不同时间点关键蛋白的表达变化,发现聚蛋白聚糖、片段化的聚蛋白聚糖、具有血小板反应蛋白基序和解聚素的金属蛋白酶4的表达有时间相关性变化趋势,变化不明显;金属蛋白酶5表达量在造模后无明显变化;透明质酸连接蛋白在12小时表达显著升高。HYBID 12小时mRNA水平是空白对照组的30倍,并且明显高于其他各时间点(P<0.001),故选取HYBID作为后续实验的靶蛋白并在造模后12小时检测。3.IL-1β和TNF-α联用刺激OUMS27细胞6小时后,加入α-葡糖基芦丁等四种药物再作用于模型组6小时,mRNA检测12小时后,除吲哚美辛外,α-葡糖基芦丁、吡喹酮和阿司匹林均对HYBID表达有显著负调节作用(P<0.001)。4.由于炎症信号触发的AKT、ERK、p38三条经典信号通路均在短期内被活化,分别采用5μM和50μM抑制剂发现AKT、ERK、p38均对HYBID表达有调控作用。其中50μM ERK抑制剂对HYBID的mRNA表达有着显著的抑制作用(P<0.001),而进一步探究ERK上下游的实验发现,作为ERK通路上信号传导蛋白的JAK以及p90被活化,并且抑制其活性也能降低HYBID的表达,故初步推断JAK/ERK/p90是调控HYBID的主导信号通路(P<0.001)。结论:一药多用理论在众多疾病中有非常广泛的应用前景,本课题研究发现1μMα-葡糖基芦丁可能通过JAK/ERK/p90信号通路抑制关键蛋白HYBID的表达,从而对体外骨关节炎模型有保护作用。