研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种在老龄人群高发的神经系统退行性疾病,是导致60%-80%老年人认知功能障碍的首要病因。AD临床表现为逐渐加重的记忆、认知和执行功能障碍,最终导致患者社交能力及生活自理能力的彻底丧失,其主要病理改变包括脑萎缩、皮层和海马神经元大量丢失和突触减少、细胞外β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)过度沉积形成老年斑(senile plague,SP)、细胞内tau蛋白异常磷酸化形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)。目前认为AD是一种遗传异质性疾病,发病机制非常复杂,至今尚不完全清楚。针对AD的发病机制国内外研究者提出了多种假说和猜想,包括胆碱能假说、Aβ蛋白级联假说、Tau蛋白过度磷酸化假说、线粒体级联假说、神经炎症假说等。其中Aβ蛋白级联假说仍是目前的主导学说,最初由Hardy和Higgins在1992年首先提出,该假说认为淀粉样斑块的主要成分Aβ的过量产生是AD病理学的起始事件,是导致神经元死亡、突触丢失、tau蛋白异常磷酸化、认知功能下降的主要原因。Aβ是β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)水解产生的多肽,在脑内以单体、可溶性寡聚体和纤维体等多种形式存在。早期研究认为斑块内纤维状Aβ对神经元和突触毒性最大,然而后续各种证据表明淀粉样蛋白斑块水平与神经变性水平和分布以及认知能力下降并无明显关联。最近Selkoe等学者提出Aβ的神经毒性主要来自可溶性Aβ寡聚体,而Aβ单体和纤维体的毒性作用较弱,目前该观点已得到很多临床研究支持。体内外研究都发现Aβ寡聚体作用下神经元可出现凋亡、突触受损、tau蛋白磷酸化等病理生理改变。首先,Aβ寡聚体可以诱导神经元出现细胞皱缩、胞质致密、核崩解、染色质固缩、凋亡小体和DNA ladder形成等凋亡的典型病理学改变,其次,研究发现极低浓度的Aβ寡聚体就可以诱导突触形态和功能异常甚至突触丢失,最后,Aβ可通过激活糖原合成激酶3β(GSK-3β),诱导tau蛋白磷酸化,破坏微管稳定性,引起神经元死亡。但是Aβ寡聚体造成上述神经毒性的机制尚未明确,目前研究认为Aβ可以通过诱发线粒体功能障碍、干扰细胞信号转导通路、产生过度氧化应激、诱发钙离子水平紊乱和激活胶质细胞炎性反应等多种级联反应导致神经元凋亡和突触损伤,而且上述级联反应之间并不相互独立,而是相互交错、互相影响的。线粒体功能障碍在Aβ神经毒性机制中扮演非常重要的角色。作为细胞生命所必需的能量生成细胞器,线粒体功能障碍与氧化应激、细胞凋亡、突触损害的关系密切。大量研究发现线粒体特别容易受到Aβ毒性的影响。Aβ可显著抑制细胞色素C氧化酶和α酮戊二酸脱氢酶的活性,破坏线粒体能量产生,加剧氧化应激,另外Aβ还可通过直接作用于多个线粒体蛋白,导致线粒体渗透性转换孔开放、钙离子内流和线粒体膜电位下降。功能被破坏的线粒体进一步加剧氧化应激和钙离子稳态失衡,形成恶性循环,最终导致神经元凋亡和突触受损。此外还有研究证实线粒体功能障碍会影响tau蛋白磷酸化和神经炎性反应。据此,我们认为如能发现一种可以显著减轻Aβ诱导的线粒体功能障碍的药物,会给AD的治疗研究带来新的前景。研究发现Aβ可通过影响丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatide linositol-3-kinase/serine threonine kinase,PI3K/AKT)、核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)及Wnt等多种信号通路诱导神经元凋亡及突触损伤。PI3K/AKT通路是一种经典的抗凋亡通路,在细胞增殖、分化、凋亡及代谢的过程发挥重要作用。研究证实Aβ可以通过作用于α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)、胰岛素受体进而抑制AKT磷酸化,诱发Bax、Bad、p53等凋亡蛋白的表达异常,增加线粒体和内质网膜通透性,促进神经元凋亡。而激活PI3K/AKT信号通路可以有效拮抗Aβ导致的神经元凋亡及突触受损。细胞外调节蛋白激酶(extra cellular regulated protein kinase,ERK)信号通路是MAPK信号通路家族的重要成员之一,能将细胞外的刺激信号转导至细胞核,主要参与细胞的存活、增殖、分化的调控。既往研究发现AD病理过程中ERK信号通路是过度激活的,而且ERK通路过度激活与Aβ诱导神经元凋亡和突触可塑性功能受损关系密切。随着人口老龄化加剧,AD的发病形势愈发严峻,但是近年来AD相关药物临床试验却屡屡宣布失败,因而开发有效的治疗药物迫在眉睫。丁基苯酞(3-n-butylphathilide,NBP)是我国自主研发的缺血性脑卒中治疗药物,为人工合成的消旋体,含有L型和D型两种异构体。其中,左旋丁基苯酞(L-3-n-butylphthalide,L-NBP)是该药物的主要药理成分,最早是从芹菜籽中提取的。早期研究发现L-NBP不但具有抑制血小板聚集和血栓形成、保护血管内皮细胞、重构微循环进而改善缺血区血流量的作用,还可以显著改善缺血区能量代谢、减少神经细胞凋亡,在缺血性脑卒中的治疗中具有出色表现。近期研究发现L-NBP能显著改善AD小鼠的认知功能,减少AD鼠脑内的Aβ斑块沉积、降低氧化应激水平、抑制胶质细胞激活、减少神经元凋亡并改善突触功能。但是,目前L-NBP抑制Aβ1-42寡聚体导致的神经元凋亡和突触受损的机制尚不明确,与Aβ诱导神经元凋亡和突触受损密切相关的PI3K/AKT、ERK信号通路在此过程中发挥怎样的作用亦不清楚。在总结前期研究工作的基础上,我们设计了本实验,从体外和体内两方面研究L-NBP抑制Aβ1-42寡聚体所致神经损伤的保护作用,并从分子和信号通路水平探索其可能的作用机制。在体外研究中,我们采用Aβ1-42:寡聚体作为损伤剂作用于原代培养神经元,并使用梯度浓度的L-NBP预处理,检测L-NBP对Aβ1-42寡聚体导致的细胞毒性、线粒体膜电位下降、神经元凋亡、突触丢失及tau蛋白磷酸化的影响。在体内研究中,我们采用向SD大鼠侧脑室灌注Aβ1-42寡聚体的方法制备AD动物模型,并给予L-NBP灌胃,检测L-NBP对Aβ1-42寡聚体导致的SD大鼠学习记忆能力、皮层细胞凋亡和tau蛋白磷酸化的影响。在体内外证实L-NBP对Aβ寡聚体引起神经损伤具有保护作用的基础上,进一步探索线粒体膜电位、PI3K/AKT和ERK信号通路在此过程中的变化,阐明L-NBP发挥保护作用的可能分子机制。第一章左旋丁基苯酞抑制Aβ1-42寡聚体所致神经损伤第一节左旋丁基苯酞抑制Aβ1-42寡聚体所致神经损伤的体外研究[研究目的]通过检测L-NBP对Aβ1-42寡聚体导致的细胞毒性、线粒体膜电位下降、神经元凋亡、突触丢失及tau蛋白磷酸化的影响,明确L-NBP是否抑制Aβ1-42寡聚体对原代培养神经元产生的神经损伤。[研究方法]采用Aβ1-42寡聚体作用于原代培养皮层神经元制备AD体外模型,并使用梯度浓度的L-NBP预先孵育4小时,将神经元随机分为5个处理组:①空白对照组,没有任何处理;②Aβ1-42处理组(10μmol/L Aβ1-42孵育24小时);③Aβ1-42+0.1 μmol/L L-NBP 预处理组;④Aβ1-42+1 μmol/L L-NBP 预处理组;⑤Aβ1-42+10μmol/L L-NBP预处理组。培养结束后,通过MTT法检测细胞存活率,采用Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡,应用细胞免疫荧光染色法对突触素(synaptophysin)蛋白进行染色,观察突触形态和分布,并检测其荧光强度,采用JC-1染色流式分析法检测线粒体膜电位下降,并通过Western blot法检测p-tau、total-tau、pro-caspase-3、cleaved caspase-3 和 synaptophysin 蛋白的表达。[研究结果]1.与空白对照组对比,Aβ1-42处理组细胞存活率明显降低、呈现典型凋亡形态的神经元比率明显增高、线粒体膜电位下降的细胞比率明显增高、p-tau和cleaved caspase-3 蛋白表达水平显著增高、synaptophysin 和 pro-caspase-3 蛋白表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.01)。2.与Aβ1-42处理组对比,L-NBP处理组细胞存活率明显增高、呈现典型凋亡形态的神经元比率降低、线粒体膜电位下降的细胞比率降低、p-tau和cleaved caspase-3蛋白表达水平明显降低、synaptophysin和pro-caspase-3蛋白表达水平明显增高,差异均具有统计学意义(P<0.05),且呈现出明显的浓度依赖性。[研究结论]L-NBP能够显著抑制Aβ1-42寡聚体导致的细胞毒性、线粒体膜电位降低、tau蛋白磷酸化、神经元凋亡和突触丢失,在体外抑制Aβ1-42寡聚体产生的神经损伤。第二节左旋丁基苯酞抑制Aβ1-42寡聚体所致神经损伤的体内研究[研究目的]通过检测L-NBP对Aβ1-42寡聚体作用下SD大鼠学习记忆能力、皮层细胞凋亡和tau蛋白磷酸化的影响,明确L-NBP是否抑制Aβ1-42寡聚体对SD大鼠产生的神经损伤。[研究方法]采用向SD大鼠侧脑室灌注Aβ1-42寡聚体的方法制备AD动物模型,假手术组大鼠侧脑室注入等量生理盐水,L-NBP治疗组大鼠给予L-NBP灌胃,Aβ1-42模型组大鼠给予植物油灌胃。处理完成后,采用避暗箱完成被动回避实验检测大鼠的学习记忆能力,对皮层脑组织进行TUNEL染色检测细胞凋亡情况,提取皮层蛋白并采用Western blot法检测p-tau蛋白的表达情况。[研究结果]1.与假手术组对比,Aβ1-42模型组大鼠进入暗室的潜伏期明显缩短,5分钟内错误进入暗室的次数明显增多,皮层细胞凋亡增多,p-tau蛋白表达水平增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.与Aβ1-42模型组对比,L-NBP治疗组大鼠进入暗室的潜伏期明显延长,5分钟内错误进入暗室的次数有所减少,皮层细胞凋亡明显减少,p-tau蛋白表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。[研究结论]L-NBP能显著改善侧脑室灌注Aβ1-42寡聚体SD大鼠的学习记忆能力、减少皮层神经细胞凋亡、抑制tau蛋白过度磷酸化,从体内抑制Aβ1-42寡聚体产生的神经损伤。第二章左旋丁基苯酞通过影响PI3K/AKT和ERK信号通路抑制Aβ1-42寡聚体所致神经损伤[研究目的]研究PI3K/AKT和ERK信号通路在Aβ1-42寡聚体导致神经损伤中的作用,并进一步探索L-NBP通过调节PI3K/AKT和ERK信号通路发挥保护作用的机制。[研究方法]1.采用Aβ1-42寡聚体作用于原代培养皮层神经元制备AD细胞模型,并使用梯度浓度的L-NBP预先孵育4小时,将神经元随机分为5个处理组:①空白对照组,没有任何处理;②Aβ1-42处理组(10μmol/L Aβ1-42孵育24小时);③Aβ1-42+0.1μmol/L L-NBP 预处理组;④Aβ142+1 μmol/L L-NBP 预处理组;⑤Aβ1-42+10μmol/L L-NBP预处理组。结束培养后,采用Western blot法检测p-AKT、total AKT、p-ERK、total ERK 蛋白表达水平。2.采用Aβ1-42寡聚体作用于原代培养皮层神经元制备AD细胞模型,在加入L-NBP前使用梯度浓度的LY294002预先孵育1小时,将神经元随机分为6个处理组:①空白对照组,没有任何处理;②Aβ1-42处理组(10μmol/L Aβ1-42孵育 24 小时);③Aβ1-42+10μmol/L L-NBP 预处理组;④Aβ1-42+20μmol/L LY294002+10μmol/L L-NBP 处理组;⑤Aβ1-42+40μmol/L LY294002+10μmol/L L-NBP 处理组;⑥Aβ1-42+60μmol/L LY294002+10μmol/L L-NBP 处理组。结束培养后,使用MTT法检测各个处理组的细胞存活率。3.采用Aβ1-42寡聚体作用于原代培养皮层神经元制备AD细胞模型,在加入L-NBP之前分别使用LY294002和U0126预先孵育1小时,将神经元随机分为4个处理组:①空白对照组,没有任何处理;②Aβ1-42处理组(10μmol/L Aβ1-42孵育24小时);@Aβ1-42+10μmol/L L-NBP处理组;④Aβ1-42+60μmol/L LY294002+10μmol/L L-NBP 处理组或 Aβ1-42+10μmol/L U0126+10μmol/L L-NBP处理组。结束培养后,采用JC-1染色流式分析法检测线粒体膜电位下降,通过Western blot 法检测 p-tau、total-tau、cleaved caspase-3、synaptophysin、p-AKT、total AKT、β-catenin、p-ERK、total ERK 蛋白表达水平。[研究结果]1.与空白对照组相比,Aβ1-42处理组p-AKT蛋白表达水平明显降低,p-ERK蛋白表达水平明显增高,差异具有统计学意义(P<0.01);与Aβ1-42处理组相比,L-NBP处理组p-AKT蛋白表达水平增高,p-ERK蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。各处理组之间total AKT和total ERK蛋白表达水平未见明显差异。结果提示,L-NBP可以逆转Aβ1-42寡聚体导致的AKT去磷酸化和ERK磷酸化。2.与空白对照组相比,Aβ1-42处理组的细胞存活率明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与Aβ1-42处理组相比,L-NBP预处理组细胞存活率明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与L-NBP预处理组相比,Aβ1-42+40μmol/L LY294002+L-NBP 处理组和 Aβ1-42+60μmol/L LY294002+L-NBP 处理组细胞存活率明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果提示,应用LY294002抑制AKT磷酸化可以阻断L-NBP抑制细胞毒性的保护作用。3.与空白对照组相比,Aβ1-42处理组线粒体膜电位下降的细胞比率增高、p-AKT、β-catenin、synaptophysin 蛋白表达水平降低,p-tau 蛋白和 cleaved caspase-3蛋白表达水平增高,差异均具有统计学意义(P<0.01)。与Aβ1-42处理组相比,L-NBP预处理组线粒体膜电位下降的细胞比率降低、p-AKT、β-catenin、synaptophysin蛋白表达水平增高,p-tau蛋白和cleaved caspase-3蛋白表达水平降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与L-NBP预处理组相比,Aβ1-42+LY294002+L-NBP处理组的线粒体膜电位下降的细胞比率增高、p-AKT、β-catenin、synaptophysin 蛋白表达水平降低,p-tau 蛋白和 cleaved caspase-3 蛋白表达水平增高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果提示,应用LY294002抑制AKT磷酸化可以阻断L-NBP抑制线粒体膜电位下降、tau蛋白磷酸化、神经元凋亡和突触丢失的保护作用。4.与空白对照组相比,Aβ1-42处理组p-ERK和cleaved caspase-3蛋白表达明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。与Aβ1-42处理组相比,L-NBP预孵育组p-ERK和cleaved caspase-3蛋白表达水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与 L-NBP 预处理组相比,Aβ1-42+U0126+L-NBP 处理组 p-ERK 和 cleaved caspase-3的表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果提示,应用U0126抑制ERK磷酸化可以协同L-NBP抑制神经元凋亡。[研究结论]L-NBP能有效地抑制Aβ1-42寡聚体诱导的细胞毒性,线粒体功能障碍,细胞凋亡和突触丢失,而且L-NBP发挥上述保护作用的同时伴随着AKT的磷酸化水平增加和ERK的磷酸化水平降低。应用LY294002抑制AKT磷酸化可以阻断L-NBP的上述保护作用。另外,应用U0126抑制ERK磷酸化可以协同L-NBP抑制神经元凋亡。因此我们认为L-NBP通过调节PI3K/AKT和ERK信号通路抑制Aβ1-42寡聚体所致的神经损伤。