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目的:利用SIK2敲低细胞系,研究SIK2敲低对细胞DNA辐射损伤修复能力的影响,推测SIK2在辐射损伤修复中的作用。分别在细胞水平和体外检测 SIK2与DNA-PKcs之间的相互作用,进一步明确其相互作用与细胞周期的关系及相互作用的区域。 方法:将HeLa-shNC细胞和HeLa-shSIK2细胞经4Gyγ射线照射,利用彗星电泳检测其相应时间点的尾矩,以此判断它们DNA辐射损伤修复能力的差异,并推测SIK2在DNA损伤修复中的作用。利用TdR双阻断法将HeLa细胞同步于G1/S期,然后释放出来,应用流式细胞术和细胞免疫共沉淀技术,分别检测SIK2和DNA-PKcs蛋白在S期(释放后2h)、G2/M期(释放后9h)和G1期(释放后12h)相互作用的强弱,以此推测二者相互作用的细胞周期时相相关性。设计SIK2及其截短体引物,运用PCR方法分别扩增SIK2、SIK2-Δ1(280~926)、SIK2-Δ2(400~926)、SIK2-Δ3(1~400)、SIK2-Δ4(700~926)五个基因片段,将目的片段插入原核表达载体pGEX-4T-2中,构建GST标签的重组质粒。将构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导SIK2、SIK2-Δ1、SIK2-Δ2、SIK2-Δ3、SIK2-Δ4和GST空载的原核表达,用考马斯亮蓝染色和Western blot进行鉴定。用诱导表达成功的GST-SIK2、GST-SIK2-Δ1、GST-SIK2-Δ2、GST-SIK2-Δ4蛋白与内源性DNA-PKcs蛋白行GST pull-down实验,检测SIK2蛋白与DNA-PKcs蛋白在体外的相互作用及相互作用区域。 结果:1.彗星电泳显示,HeLa-shSIK2的尾矩在照射完1h和2h较HeLa-shNC长,说明SIK2敲低后,细胞对于辐射诱发DNA损伤的修复能力降低,SIK2可能参与辐射诱发的DNA损伤修复。2.用TdR双阻断法分别使细胞同步化于S期、G2/M期和G1期,用免疫共沉淀技术分别检测二者在这三个时期的相互作用,结果发现,二者在整个细胞周期都有作用,其中G2/M期和G1期形成的蛋白复合物较多,提示它们可能主要在G2/M期和G1期相互作用。3.成功构建了SIK2及其截短体的原核表达重组体,并用IPTG诱导表达,用考马斯亮蓝染色及 Western blot鉴定显示,GST-SIK1~926、GST-SIK280~926、GST-SIK400~926、GST-SIK1~400、GST-SIK700~926和GST分别位于130KD、110KD、84KD、72KD、54KD和26KD左右,均与预期分子量大小相符。4.用GST pull-down检测SIK2蛋白与DNA-PKcs蛋白的体外相互作用时发现,GST-SIK1~926、GST-SIK280~926和GST-SIK400~926在体外能与DNA-PKcs相结合,而GST-SIK700~926在体外不能结合DNA-PKcs,由此推测,在体外能与DNA-PKcs结合的区域位于SIK2的PKA结合结构域。 结论:1.SIK2敲低后,导致细胞的DNA辐射损伤修复能力减弱,表明 SIK2可能参与辐射诱发的DNA辐射损伤修复。2.在细胞中,SIK2能与DNA-PKcs发生相互作用,它们发生相互作用的细胞周期时相主要为G2/M期和G1期。3.构建了SIK2及其截短体的原核表达重组体,并成功地在大肠杆菌中诱导表达。4.在体外,SIK2能与DNA-PKcs相结合,结合位点位于SIK2的PKA结合结构域。