目的:糖尿病(diabetes mellitus, DM)慢性血管并发症包括大血管和微血管的病变,如动脉硬化和糖尿病肾病,是DM致死、致残的主要原因。然而,目前糖尿病血管病变的发病机制尚不完全清楚,其中氧化应激和炎症损伤被广泛认为是重要的机制。DM时,诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)可被诱导而活性增强,导致损伤。已有体外的研究报道,iNOS和COX-2之间存在相互作用。然而,在体内状态下iNOS和COX-2之间是否存在相互作用,其相互作用与糖尿病血管病变发病和进展的关系未见报道。DM时,过量的NO可与超氧阴离子(superoxide, O2-.)快速反应生成过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-)。ONOO-可引起蛋白质中酪氨酸残基明显的硝基化。一旦蛋白质被ONOO-引起硝基化,它们的结构和功能就会受到影响。而ONOO-引起的iNOS和COX-2的硝基化,对两者体内状态下,特别是糖尿病血管病变中的相互作用有何影响尚未见报道。尿酸盐(Urate)是特异的内源性ONOO-清除剂。滋阴活血方药(Nourishing Yin and Promoting Blood flow Recipe,NYPBR)是前期系列研究防治糖尿病并发症的核心方剂。本实验采用健康雄性Wistar大鼠,链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)复制DM模型,随机分为四组:正常组、DM组、Urate组、NYPBR组。实验中,检测iNOS和COX-2的转录水平、蛋白含量、两者的共定位和相互作用,以及iNOS和COX-2的硝基化水平,旨在探讨DM大鼠体内,iNOS和COX-2之间是否存在相互作用;iNOS和COX-2的相互作用与糖尿病大血管和微血管病变发病与进展的关系;ONOO-所致的iNOS、COX-2硝基化对其相互作用的影响;NYPBR防治作用机制是否是通过降低iNOS和COX-2的硝基化,影响其相互作用,从而起到防治糖尿病血管病变的目的。方法:1动物分组与取材健康雄性Wistar大鼠(407.05±59.51g)36只,随机分为4组,正常组(8只),DM组(10只),Urate组(9只),NYPBR组(9只),后三组腹腔内注射STZ溶液(STZ溶于浓度为0.1mol/L的柠檬酸纳缓冲液,pH4.4,新鲜配制,终浓度为10mg/mL,按40mg/kg注射)制备DM模型,正常组注射等剂量生理盐水。注射3天后,测空腹血糖,高于13mmol/L,尿糖+++以上,为造模成功。以上四组正常饮食喂养,正常组和DM组自由饮水,Urate组用Urate水溶液灌养(160mg/kg/d),NYPBR组按人与动物间体表面积折算的等效剂量比值灌胃给药(含生药1g/mL),每只大鼠3mL/天。20-25℃室温下喂养13周后,检测血糖、体重一次,股动脉放血处死,迅速剥离胸腹主动脉及肾组织,取一段主动脉及肾皮质用作形态学观察及激光共聚焦分析;剩余的主动脉和肾皮质迅速置于液氮中,-70℃冰箱保存,用于提取RNA,Western blotting,免疫共沉淀等分子生物学检测。2形态学观察主动脉内皮、肾皮质光镜和透射电镜下观察。3主动脉及肾皮质中iNOS和COX-2转录水平的检测Trizol一步法分别提取主动脉和肾皮质中总RNA;用β-actin做内参,RT-PCR方法检测iNOS和COX-2的mRNA表达。4主动脉及肾皮质中iNOS和COX-2蛋白含量及硝基化水平的检测分别取主动脉和肾皮质,匀浆后,Lowry法测定蛋白含量,Western-blotting检测主动脉及肾皮质中iNOS和COX-2的蛋白含量和其硝基化水平,即NT含量。5主动脉及肾皮质中iNOS和COX-2的共定位分别取主动脉和肾皮质,用激光共聚焦显微镜检测iNOS和COX-2的蛋白含量及其共定位。6主动脉及肾皮质中iNOS和COX-2的相互作用和硝基化水平6.1分别取主动脉和肾皮质,匀浆后,Lowry法测定蛋白含量,iNOS和COX-2的免疫共沉淀检测其相互作用。6.2 Western-blotting检测沉淀的iNOS和COX-2蛋白含量及其硝基化水平,即NT含量。结果:1大鼠的一般表现,Urate及NYPBR对大鼠血糖和体重的影响。造模3天后,DM组(21.68±2.95)、Urate组(23.28±3.98)和NYPBR组(21.93±3.93)血糖均较正常组(5.84±0.17)显著升高(P<0.001)。DM组大鼠逐渐出现消瘦,皮毛无光泽、疏松,反应迟钝,多饮、多尿、多食、生长迟缓等症状。Urate组和NYPBR组明显好于DM组。13周病程结束时,DM组血糖(22.20±5.57)明显高于正常组(6.05±0.94) ,体重(347.30±43.15)明显低于正常组(521.2±81.74),有显著性差异(P<0.001)。Urate组血糖(18.88±3.21)与体重(320.44±61.78)均与DM组无差异。NYPBR组血糖(14.79±3.07)明显低于DM组(P<0.01),体重(340.89±51.24)与DM组无差异。2主动脉形态学观察主动脉光镜(×400)下观察:正常组主动脉内皮完整,DM组内皮广泛脱落,Urate组和NYPBR组,主动脉内皮形态学改变介于以上两组之间。NYPBR组较Urate组的病理改变减轻。主动脉透射电镜(×20K或×40K)下观察:正常组内皮细胞内可见到大量吞饮小泡,线粒体完整。DM组内皮细胞可见大部分线粒体膜溶解、嵴消失,细胞连接融合或消失。Urate组和NYPBR组,内皮细胞线粒体的形态学改变减轻,细胞连接部分融合。NYPBR组较Urate组的病理改变减轻。3肾小球形态学观察肾小球光镜(×400)下观察:正常组肾小球未见异常,糖原染色可见基底膜薄而清晰。DM组,可见到肾小球纤维化、肾小囊腔增大,糖原染色可见基底膜增厚。Urate组和NYPBR组肾小球的形态学改变介于以上两组之间。NYPBR组较Urate组的病理改变减轻。肾小球透射电镜(×10K、×15K或×20K)下观察:正常组肾小球未见异常。DM组,可见系膜细胞及足突融合、基底膜增厚。Urate组和NYPBR组肾小球的形态学改变介于以上两组之间。NYPBR组较Urate组的病理改变减轻。4主动脉iNOS和COX-2转录水平的变化正常组iNOS和COX-2的mRNA表达未检测出,DM组iNOS的mRNA表达(0.57±0.05)、COX-2的mRNA表达(0.49±0.06)均明显增高。Urate组iNOS的mRNA表达(0.28±0.01)、COX-2的mRNA表达(0.29±0.02)较DM组显著降低(P<0.01)。NYPBR组iNOS的mRNA表达(0.22±0.03)、COX-2的mRNA表达(0.29±0.03)较DM组显著降低(P<0.01)。5肾皮质iNOS和COX-2转录水平的变化正常组iNOS和COX-2的mRNA表达未检测出,DM组iNOS的mRNA表达(0.43±0.07)、COX-2的mRNA表达(0.56±0.05)均明显增高。Urate组iNOS的mRNA表达(0.22±0.03)、COX-2的mRNA表达(0.22±0.03)较DM组显著降低(P<0.01)。NYPBR组iNOS的mRNA表达(0.11±0.03)、COX-2的mRNA表达(0.33±0.07)较DM组显著降低(P<0.01或P<0.05)。6主动脉iNOS和COX-2蛋白含量及其硝基化水平的变化正常组iNOS和COX-2的蛋白含量未检测出,DM组iNOS的蛋白含量(60.67±6.66)及其硝基化水平(0.83±0.14)、COX-2的蛋白含量(204.33±6.66)及其硝基化水平(0.43±0.02)均明显增高。Urate组iNOS的蛋白含量(44±5.29)及其硝基化水平(0.44±0.04)、COX-2的蛋白含量(158.67±19.5)及其硝基化水平(0.37±0.03)均比DM组降低(P<0.05)。NYPBR组iNOS的蛋白含量(47±2.65)及其硝基化水平(0.36±0.06)、COX-2的蛋白含量(161.67±12.1)及其硝基化水平(0.3±0.05)均比DM组降低(P<0.01或P<0.05)。7肾皮质iNOS和COX-2蛋白含量及其硝基化水平的变化正常组iNOS和COX-2的蛋白含量未检测出,DM组iNOS的蛋白含量(205.67±26.76)及其硝基化水平(0.54±0.02)、COX-2的蛋白含量(281.67±28.75)及其硝基化水平(1.64±0.12)均明显增高。Urate组iNOS的蛋白含量(142±10.54)及其硝基化水平(0.39±0.06)、COX-2的蛋白含量(182±8.62)及其硝基化水平(0.95±0.1)均比DM组降低(P<0.01或P<0.05)。NYPBR组iNOS的蛋白含量(131.67±11.02)及其硝基化水平(0.45±0.04)、COX-2的蛋白含量(152.33±9.07)及其硝基化水平(0.85±0.05)均比DM组降低(P<0.01或P<0.05)。8主动脉iNOS和COX-2蛋白含量及其共定位正常组,iNOS和COX-2的蛋白含量和共定位未检测出。DM组,iNOS蛋白含量(61.6±9.95)和COX-2蛋白含量(60.7±8.96)均显著增高,并出现明显的黄色,即iNOS和COX-2的共定位。Urate组,iNOS蛋白含量(23.24±4.15)和COX-2蛋白含量(42.38±4.2)比DM组降低(P<0.01或P<0.05),黄色减弱。NYPBR组,iNOS蛋白含量(17.65±4.34)和COX-2蛋白含量(25.18±3.69)比DM组降低(P<0.01),黄色减弱。9肾皮质iNOS和COX-2蛋白含量及其共定位正常组,iNOS和COX-2的蛋白含量和共定位未检测出。DM组,iNOS蛋白含量(20.52±2.73)和COX-2蛋白含量(16±1.59)均显著增高,并出现明显的黄色,即iNOS和COX-2的共定位。Urate组,iNOS蛋白含量(2.7±0.6)和COX-2蛋白含量(9.95±2.23)比DM组降低,黄色减弱(P<0.01或P<0.05)。NYPBR组,iNOS蛋白含量(4.75±2.28)和COX-2蛋白含量(10.91±2.05)比DM组降低,黄色减弱(P<0.01或P<0.05)。10主动脉iNOS和COX-2的相互作用及硝基化水平正常组,iNOS和COX-2的相互作用未检测出。DM组,发生相互作用的iNOS(0.92±0.12)及其硝基化水平(0.94±0.03)、COX-2(0.83±0.09)及其硝基化水平(1.3±0.11)均明显增加。Urate组发生相互作用的iNOS(0.65±0.09)及其硝基化水平(0.75±0.07)、COX-2(0.64±0.05)及其硝基化水平(1.08±0.07)均比DM组显著降低(P<0.05)。NYPBR组发生相互作用的iNOS(0.71±0.03)及其硝基化水平(0.85±0.03)、COX-2(0.55±0.12)及其硝基化水平(1.05±0.09)均比DM组显著降低(P<0.05)。11肾皮质iNOS和COX-2的相互作用及硝基化水平正常组,iNOS和COX-2的相互作用未检测出。DM组,发生相互作用的iNOS(0.8±0.03)及其硝基化水平(1.14±0.07)、COX-2(0.57±0.05)及其硝基化水平(1.21±0.09)均明显增加。Urate组发生相互作用的iNOS(0.6±0.07)及其硝基化水平(1.01±0.02)、COX-2(0.47±0.02)及其硝基化水平(1.02±0.06)均比DM组显著降低(P<0.05)。NYPBR组发生相互作用的iNOS(0.7±0.04)及其硝基化水平(0.84±0.09)、COX-2(0.44±0.05)及其硝基化水平(1.02±0.06)均比DM组显著降低(P<0.05)。结论:1 DM大鼠主动脉和肾皮质中,iNOS和COX-2的mRNA表达水平、蛋白含量均显著增高,并出现明显的共定位,提示糖尿病血管病变中,iNOS和COX-2之间可能存在相互作用。2 iNOS和COX-2相互作用的强弱与主动脉及肾小球的病理变化相一致,提示iNOS和COX-2的相互作用在糖尿病大血管和微血管病变发病中可能起重要作用。3 DM大鼠主动脉和肾皮质iNOS和COX-2被硝基化,且相互作用增强。Urate抑制硝基化后,iNOS和COX-2的相互作用减弱,病理损伤减轻。表明硝基化可增强iNOS和COX-2之间的相互作用,抑制iNOS和COX-2硝基化,可能在防治糖尿病血管病变中起关键作用。4 NYPBR可以抑制DM大鼠主动脉和肾皮质中iNOS和COX-2的硝基化,减弱其相互作用,起到防治糖尿病血管病变的作用。