研究背景复发性流产是指连续发生3次及3次以上妊娠28周前的胎儿丢失。国际上对于复发性流产的定义还没有达成共识,主要区别在于流产次数、流产孕周、是否包括生化妊娠等方面。复发性流产的病因复杂多样,主要包括以下几个方面:遗传因素、解剖因素、内分泌因素、抗磷脂抗体综合征、环境因素及免疫因素。免疫因素包括自身免疫因素和同种免疫因素,自然流产诊治中国专家共识（2020年版）建议对自身免疫因素,如抗磷脂综合征、系统性红斑狼疮、未分化结缔组织病、干燥综合征、类风湿关节炎和系统性硬化症等进行筛查,但是对于同种免疫因素并未建立筛查标准。免疫危险因素与复发性流产的相关性正成为科学关注的焦点,然而各国指南对免疫因素提及较少,国际指南对免疫因素的研究还存在局限性。所有指南的免疫因素几乎只关注于筛查抗磷脂抗体综合征,而忽略了即使全面、详细的筛查了遗传因素、解剖因素、内分泌因素及环境因素等病因,仍然有50%的复发性流产患者无法找到明确的病因。适当的母胎免疫耐受的调节对于胚胎着床和成功妊娠是非常重要的,然而,控制胎儿-母体界面生理耐受的确切机制仍不清楚。有研究认为,调节母体免疫识别和胎儿抗原表达的一系列机制可以预防大多数妊娠排斥反应,但当这些机制失效时,就可能导致妊娠丢失。在过去的几十年里,人们进行了大量的研究,以阐明子宫内膜接受胚胎的生物分子机制,以及参与子宫内膜容受性的特定细胞类型和细胞通路。然而,我们对这些机制的认识仍然很不完整。近年来有关外泌体的部分研究发现,外泌体在调控免疫反应中发挥一定的生物学作用。外泌体中特定细胞成分的功能性、靶向性、驱动机制等表明它们在调节细胞间通讯中发挥重要作用,同样也影响着靶细胞的免疫、增殖及凋亡。外泌体与免疫反应、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中枢神经系统相关疾病和癌症进展有关。外泌体在引发适应性和先天性免疫反应方面具有功能,支持其在治疗发展中的应用,并在协调免疫反应以应对感染因子或癌症方面发挥潜在作用。外泌体还可能通过影响受体细胞中的基因表达和信号通路来调节免疫反应。外泌体根据其来源和成分表现出免疫刺激或免疫抑制特性。越来越多的证据表明,microRNA（miRNA/miR）可以被包装到外泌体或微泡中,也可以被装载到高密度脂蛋白中。这些作用方式能保护miRNA不被降解并保证其稳定性,以此稳定地存在于体液中,包括唾液、尿液、母乳和血液,参与许多生物活动,包括细胞增殖、细胞分化、细胞迁移、疾病开始和疾病进展等。鉴于外泌体的可转运性,在外泌体的转运生物分子中,miRNA因其在物种间的高度保守性和在基因表达中广泛的调控作用而受到了越来越多的关注。miRNA功能或水平的紊乱会影响各种靶基因的表达水平,并进一步影响许多细胞的功能。miRNA也在胚胎发育等重要生命过程中发挥重要作用,miRNA生物发生机制或效应沉默因子的缺陷都会导致严重的胚胎缺陷。已有证据表明,多种miRNA对细胞增殖和凋亡具有调控作用,探索miRNA在复发性流产中的重要作用以及在妊娠局部或系统中的表达越来越重要。目前关于外泌体在女性生殖系统方面的研究主要关注于外泌体在妊娠期糖尿病、子痫前期及子宫内膜异位症等相关疾病中的发生机制,而外泌体在复发性流产方面的研究有限。复发性流产的发生机制十分复杂,其免疫性病因更是目前面临的悬而未决的难题。从已有研究发现免疫因素的异常可以引起复发性流产的发生,而外泌体又可以通过特定途径调节免疫反应。在我们开展研究之前,国内外尚无有关外泌体及外泌体中miRNA与复发性流产相关性的报道。因此我们将通过实验来研究外泌体及其miRNA与母-胎免疫耐受之间是否具有相关性。研究目的首先,进行动物实验,通过提取小鼠间充质干细胞分泌的外泌体,研究外泌体对流产小鼠胚胎吸收率的影响。探讨外泌体注射能否改善流产小鼠的妊娠结局。然后,如果这种影响存在,将进一步研究外泌体发挥作用的途径:是通过影响全身系统还是局部系统相关细胞因子的分泌来发挥作用,以及全身系统或局部系统发挥作用的相关细胞因子的差异。最后,研究外泌体注射能否改变受体细胞miRNA的表达,并进行细胞实验进一步验证miRNA的改变与复发性流产之间是否有免疫相关性。研究方法1、提取骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志CD29、CD105、CD45、CD11b、SCA-1、TER-119 的荧光强度。采用超速离心法分离骨髓间充质干细胞分泌的外泌体,透射电镜观察外泌体的结构和形貌,Western-blot检测外泌体TSG101、CD63的表达。2、选择国际通用的正常妊娠组及流产组小鼠模型,小鼠分组交配:①正常妊娠组（雌性CBA/J ×雄性BALB/c小鼠）②流产模型组（雌性CBA/J ×雄性DBA/2小鼠）③外泌体注射组（外泌体+雌性CBA/J ×雄性DBA/2小鼠）三组小鼠按照2:1的比例合笼交配,流产小鼠在妊娠第4天宫角注射100ul外泌体,研究外泌体注射对三组妊娠小鼠胚胎吸收率的影响。分离小鼠妊娠蜕膜免疫细胞,采用流式细胞仪检测对比三组蜕膜CD4+、CD8+和CD19+细胞的差异。3、全身系统以脾脏为研究物,局部系统以子宫为研究物,提取妊娠小鼠脾脏及子宫蜕膜CD4+T细胞和巨噬细胞。流式细胞仪行单细胞内细胞因子的检测,检测 CD4+T 细胞中 IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ和巨噬细胞中的 CD86、CD206、IL-10、IL-12的变化。探讨外泌体是如何影响流产小鼠免疫功能,是在小鼠全身系统发挥作用还是局部发挥作用,是通过影响T细胞还是巨噬细胞发挥作用的。4、进行细胞实验部分,采用qPCR技术检测妊娠小鼠子宫蜕膜CD4+T细胞中6组（miR-101、miR-122、miR-146b、miR-125a、miR-125b、miR-34a）与生殖系统有密切关系的miRNA的水平变化。小鼠提取CD4+T细胞,然后转染CD4+T细胞,实验分为三组①空白组,②miR-101-mimics组,③miR-101-inhitibor组。转染后48小时实时荧光定量PCR检测miR-101的表达、流式检测Th1、Th2细胞亚群的比例,收集上清液检测IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ细胞因子的变化。探讨外泌体注射能否改变受体细胞miRNA的表达,miRNA的改变与复发性流产之间是否有相关性。研究结果1、提取小鼠骨髓间充质干细胞及其分泌的外泌体并鉴定,妊娠小鼠外泌体注射发现:外泌体注射组胚胎吸收率与正常妊娠组相似,外泌体注射组与流产模型组相比胚胎吸收率明显降低（p≤0.01）。2、对比三组妊娠小鼠之间CD4+、CD8+和CD19+细胞的变化,发现三组妊娠小鼠之间CD4+、CD19+细胞未见明显变化。流产组CD8+细胞高于正常妊娠组,而外泌体注射组与流产组相比CD8+细胞明显减少（p＜0.05）。3、从脾脏中分离出CD4+T细胞和巨噬细胞,实验发现:正常妊娠组、流产模型组及外泌体注射组之间CD4+T细胞中IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平无显著差异（p＞0.05）。三组巨噬细胞中的CD86、CD206、IL-10和IL-12水平也没有显著差异（p＞0.05）。4、分离三组妊娠小鼠子宫蜕膜中的CD4+T细胞和巨噬细胞,实验发现:流产模型组CD4+T细胞中细胞因子TNF-α、IFN-γ的表达明显高于正常妊娠组,而细胞因子IL-4、IL-10的表达明显低于正常妊娠组（p≤0.01）。外泌体注射组与流产模型组相比CD4+T细胞内细胞因子TNF-α IFN-γ的表达下降,而细胞因子IL-4、IL-10的表达升高（p＜0.05）。外泌体注射组与流产组相比巨噬细胞中IL-10的表达升高（p≤0.01）、IL-12的表达下降（p＜0.05）,而对CD86和CD206的表达没有影响。5、与流产模型组相比,外泌体注射组中miR-101的表达水平增加了 7.2倍（p≤0.01）,而 miR-122、miR-146b、miR-125a、miR-125b、miR-34a 的表达水平未见明显变化（p＞0.05）。6、CD4+T细胞转染实验发现:miR-101过表达使Th2型细胞亚群的比例增加,Th2型细胞相关细胞因子IL-4、IL-10分泌增加,Th1型细胞相关细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌减少,Th1/Th2比例降低,而miR-101抑制则产生相反的结果（p≤001）。研究结论1、外泌体注射能降低流产组小鼠的胚胎吸收率,改善妊娠结局。2、外泌体注射不是通过影响小鼠全身系统的免疫功能来改善流产小鼠的妊娠结局,而是通过影响流产小鼠子宫蜕膜局部免疫细胞及胞内细胞因子的改变来影响妊娠结局,外泌体诱导CD4+T细胞向Th2型、巨噬细胞向M2型细胞漂移来诱导母-胎免疫耐受。3、外泌体注射改善流产小鼠妊娠结局是通过增加miR-101在CD4+T细胞中的表达来发挥作用。细胞实验证实,转染CD4+T细胞后,miR-101过表达能诱导CD4+T细胞向Th2型细胞分化,诱导Th2型细胞因子的分泌,进一步证明了miR-10升高能诱导母-胎免疫耐受,改善妊娠结局。