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非特异性磷脂酶C(Nonspecific phospholipase C，NPC)是一类能够水解磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)等常见膜磷脂产生sn-1，2-二酰基甘油(Diacylglycerol，DAG)和磷酸化的头部基团的磷脂酶。NPC在脂质代谢和植物信号转导中具有重要作用，参与非生物胁迫应答、植物激素信号转导等过程。作为纤维作物和油料作物，棉花具有重要的经济价值，同时也是研究细胞壁生物合成、细胞伸长和多倍体化的好材料。为了了解NPC基因在植物中的作用，有必要对棉花NPC基因家族进行系统研究。本论文克隆了陆地棉NPC基因家族相关基因，进行了结构、表达和进化分析，并对GhNPC3a的生物学功能进行了初步研究。GhNPCs的克隆、结构、表达和进化分析
利用棉花基因组测序资料，建立陆地棉（Gossypium hirsutum L.）基因组和蛋白质组本地数据库，以拟南芥NPC的序列为“种子”进行电子克隆。依据电子克隆结果设计引物，以陆地棉“中9807”的cDNA为模板进行PCR扩增，测序后确定基因序列，然后进行结构、表达特性和进化分析。结果表明，陆地棉NPC基因家族(GhNPC)由11个成员组成，分布在scaffold269.1、D03、A07、D07、A08、D11和scaffold3511_A13染色体上，可分为Ⅰ(NPC1)、Ⅱ(NPC2)、Ⅲ(NPC3、NPC4和NPC5)和Ⅳ(NPC6)四个亚家族。GhNPCs具有典型的磷酸酯酶结构域，属于磷脂酶C超家族。不同GhNPC在棉花不同组织中差异表达，在非生物胁迫下表现出不同的表达变化，不同GhNPC的顺式作用元件的类型和数量也不同，表明不同的GhNPC可能在复杂的环境响应中具有不同的生物学功能。在GhNPC的11个成员中，有4对GhNPCs(GhNPC1a和GhNPC1b、GhNPC2a和GhNPC2b、GhNPC6a和GhNPC6b、GhNPC6c和GhNPC6d)是全基因组复制重复基因。这4对GhNPCs的Ka/Ks的值都小于1，表明它们经历了纯化选择，是亚功能化基因。进化分析发现GhNPC3b和GhNPC4来源于雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii），而GhNPC1b、GhNPC6a和GhNPC6b来源于亚洲棉（Gossypium arboreum）。
GhNPC3a具有溶血磷脂酸磷酸酶活性
GhNPC3a编码含有554个氨基酸的蛋白，预测编码蛋白的分子量为66.2kDa。利用原核细胞表达的GhNPC3a蛋白，以PC、PE等常见膜磷脂为底物进行酶活性检测，未检测到二酰基甘油的产生，表明GhNPC3a不具有非特异性磷脂酶C的水解酶活性。以溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)为底物对GhNPC3a进行酶活性测定，检测到了单酰基甘油(Monoacylglycerol，MAG)的生成，说明GhNPC3a具有LPA磷酸酶活性。为了确定GhNPC3a的底物特异性，分别以14:0-LPA、16:0-LPA、18:0-LPA、18:1-LPA为底物进行酶活性测定，发现GhNPC3a对不同类型的LPA都具有水解活性，底物为18:0-LPA时酶活性最高。GhNPC3a的酶活性受pH和温度的影响，在30℃、pH6.0时酶活性最高，但在20℃和50℃下仍表现出较高酶活性，在pH4.0和pH8.0下也可保持一定酶活性。过表达GhNPC3a基因影响棉花种子成熟过程中三酰基甘油(Triacylglycerol，TAG)的合成
对棉花种子进行油体观察，发现过表达GhNPC3a棉花种子中油体的数目显著多于野生型。对棉花种子中TAG的含量进行测定，发现过表达GhNPC3a棉花种子中52:7-TAG、53:1-TAG、54:5-TAG、56:6-TAG和58:9-TAG的含量显著高于野生型。GhNPC3a能够水解LPA生成MAG，MAG可在单酰基甘油酰基转移酶（Monoacylglycerol acyltransferase，MGAT）的作用下转化为DAG，DAG在二酰基甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）的作用下转化为TAG。这条途径为不依赖磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)的TAG合成途径。分析TAG合成相关基因在棉花种子发育过程中的转录水平变化，发现GhNPC3a在5DPA（Days post-anthesis，花后天数）时转录水平最高，而MGAT在15DPA时转录水平最高。在5DPA时过表达GhNPC3a棉花种子中GhNPC3a的转录水平显著高于野生型。在5DPA和15DPA，过表达GhNPC3a棉花种子MGAT的转录水平也显著高于野生型对照。而依赖PA的TAG合成途径相关基因溶血磷脂酸酰基转移酶（LPA acyltransferase，LPAAT）基因和磷脂酸磷酸酶(Phosphatidic acid phosphatase，PAP)基因在50DPA时转录水平最高，且此时LPAAT和PAP在野生型棉花种子中的转录水平显著高于过表达GhNPC3a基因棉花种子的。因此，过表达GhNPC3a基因棉花种子可通过不依赖PA的TAG合成途径促进TAG的合成。
过表达GhNPC3a基因影响种子的萌发率及胚轴和胚根的伸长
在棉花中过表达GhNPC3a基因显著影响了种子萌发率及胚轴和胚根的伸长。过表达GhNPC3a影响棉花种子成熟时期脱落酸、赤霉素和吲哚-3-丁酸的积累，影响ABA INSENSITIVE3(ABI3)等基因的转录水平，显著降低了棉花种子的萌发率。过表达GhNPC3a基因影响棉花种子萌发过程中脱落酸、赤霉素和吲哚-3-乙酸的含量和动态变化，在一定范围内过表达GhNPC3a基因促进了萌发种子胚轴和胚根的伸长，但GhNPC3a表达水平过高对胚轴和胚根的伸长有抑制作用。当GhNPC3a的表达水平过高时，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinases inhibitor，CKI)家族基因表达上调而细胞周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases，CDK)家族基因表达下调，棉花种子的细胞分裂速率下降，影响了胚轴和胚根的伸长;与此同时，一些细胞壁水解酶基因和扩展蛋白基因的表达下调，从而减缓细胞壁的松弛，制约了胚轴和胚根伸长。Small Auxin-Up RNA(SAUR)和Gretchen-Hagen3(GH3)在下胚轴伸长过程中有重要作用，转录组分析结果表明过表达GhNPC3a基因也可能通过影响SAUR和GH3的表达来影响棉花胚轴的伸长。过表达GhNPC3a基因还可能通过影响WUS-CLV反馈调节途径来抑制干细胞的分化，从而使胚根和胚轴不能正常伸长。在萌发异常的过表达GhNPC3a的棉花种子中，乙醛酸循环体ABC转运蛋白基因CTS/PED3/PXA1的表达下调可能导致TAG水解产生的脂肪酸不能有效地进入乙醛酸循环体进行β氧化，以致不能有效地转化为种子萌发所需的蔗糖，造成胚轴和胚根不能正常生长。
综上所述，通过对棉花NPC基因家族的系统分析和GhNPC3a的初步功能研究，发现GhNPC基因家族可能参与ABA信号转导和植物非生物胁迫应答过程。GhNPC3a是非特异性磷脂酶C的旁系同源物，具有溶血磷脂酸磷酸酶活性，能够在细胞质中水解LPA产生MAG。产生的MAG可在MGAT的作用下转化为DAG，DAG在DGAT的作用下转化为TAG。过表达GhNPC3a基因棉花种子可通过这条不依赖PA的TAG合成途径促进TAG的合成，使棉花种子中52:7-TAG、53:1-TAG、54:5-TAG、56:6-TAG和58:9-TAG的含量显著增加;过表达GhNPC3a基因还会影响种子成熟过程中和萌发阶段的激素含量，不仅显著降低了棉花种子的萌发率，而且对萌发种子胚轴和胚根的伸长产生了显著影响，即在一定范围内过表达GhNPC3a基因促进了胚轴和胚根的伸长，但GhNPC3a表达水平过高对胚轴和胚根的伸长有抑制作用。本工作加深了对植物非特异性磷脂酶C基因家族的认识，为进一步探索GhNPC家族基因功能奠定了基础。
利用棉花基因组测序资料，建立陆地棉（Gossypium hirsutum L.）基因组和蛋白质组本地数据库，以拟南芥NPC的序列为“种子”进行电子克隆。依据电子克隆结果设计引物，以陆地棉“中9807”的cDNA为模板进行PCR扩增，测序后确定基因序列，然后进行结构、表达特性和进化分析。结果表明，陆地棉NPC基因家族(GhNPC)由11个成员组成，分布在scaffold269.1、D03、A07、D07、A08、D11和scaffold3511_A13染色体上，可分为Ⅰ(NPC1)、Ⅱ(NPC2)、Ⅲ(NPC3、NPC4和NPC5)和Ⅳ(NPC6)四个亚家族。GhNPCs具有典型的磷酸酯酶结构域，属于磷脂酶C超家族。不同GhNPC在棉花不同组织中差异表达，在非生物胁迫下表现出不同的表达变化，不同GhNPC的顺式作用元件的类型和数量也不同，表明不同的GhNPC可能在复杂的环境响应中具有不同的生物学功能。在GhNPC的11个成员中，有4对GhNPCs(GhNPC1a和GhNPC1b、GhNPC2a和GhNPC2b、GhNPC6a和GhNPC6b、GhNPC6c和GhNPC6d)是全基因组复制重复基因。这4对GhNPCs的Ka/Ks的值都小于1，表明它们经历了纯化选择，是亚功能化基因。进化分析发现GhNPC3b和GhNPC4来源于雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii），而GhNPC1b、GhNPC6a和GhNPC6b来源于亚洲棉（Gossypium arboreum）。
GhNPC3a具有溶血磷脂酸磷酸酶活性
GhNPC3a编码含有554个氨基酸的蛋白，预测编码蛋白的分子量为66.2kDa。利用原核细胞表达的GhNPC3a蛋白，以PC、PE等常见膜磷脂为底物进行酶活性检测，未检测到二酰基甘油的产生，表明GhNPC3a不具有非特异性磷脂酶C的水解酶活性。以溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)为底物对GhNPC3a进行酶活性测定，检测到了单酰基甘油(Monoacylglycerol，MAG)的生成，说明GhNPC3a具有LPA磷酸酶活性。为了确定GhNPC3a的底物特异性，分别以14:0-LPA、16:0-LPA、18:0-LPA、18:1-LPA为底物进行酶活性测定，发现GhNPC3a对不同类型的LPA都具有水解活性，底物为18:0-LPA时酶活性最高。GhNPC3a的酶活性受pH和温度的影响，在30℃、pH6.0时酶活性最高，但在20℃和50℃下仍表现出较高酶活性，在pH4.0和pH8.0下也可保持一定酶活性。过表达GhNPC3a基因影响棉花种子成熟过程中三酰基甘油(Triacylglycerol，TAG)的合成
对棉花种子进行油体观察，发现过表达GhNPC3a棉花种子中油体的数目显著多于野生型。对棉花种子中TAG的含量进行测定，发现过表达GhNPC3a棉花种子中52:7-TAG、53:1-TAG、54:5-TAG、56:6-TAG和58:9-TAG的含量显著高于野生型。GhNPC3a能够水解LPA生成MAG，MAG可在单酰基甘油酰基转移酶（Monoacylglycerol acyltransferase，MGAT）的作用下转化为DAG，DAG在二酰基甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）的作用下转化为TAG。这条途径为不依赖磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)的TAG合成途径。分析TAG合成相关基因在棉花种子发育过程中的转录水平变化，发现GhNPC3a在5DPA（Days post-anthesis，花后天数）时转录水平最高，而MGAT在15DPA时转录水平最高。在5DPA时过表达GhNPC3a棉花种子中GhNPC3a的转录水平显著高于野生型。在5DPA和15DPA，过表达GhNPC3a棉花种子MGAT的转录水平也显著高于野生型对照。而依赖PA的TAG合成途径相关基因溶血磷脂酸酰基转移酶（LPA acyltransferase，LPAAT）基因和磷脂酸磷酸酶(Phosphatidic acid phosphatase，PAP)基因在50DPA时转录水平最高，且此时LPAAT和PAP在野生型棉花种子中的转录水平显著高于过表达GhNPC3a基因棉花种子的。因此，过表达GhNPC3a基因棉花种子可通过不依赖PA的TAG合成途径促进TAG的合成。
过表达GhNPC3a基因影响种子的萌发率及胚轴和胚根的伸长
在棉花中过表达GhNPC3a基因显著影响了种子萌发率及胚轴和胚根的伸长。过表达GhNPC3a影响棉花种子成熟时期脱落酸、赤霉素和吲哚-3-丁酸的积累，影响ABA INSENSITIVE3(ABI3)等基因的转录水平，显著降低了棉花种子的萌发率。过表达GhNPC3a基因影响棉花种子萌发过程中脱落酸、赤霉素和吲哚-3-乙酸的含量和动态变化，在一定范围内过表达GhNPC3a基因促进了萌发种子胚轴和胚根的伸长，但GhNPC3a表达水平过高对胚轴和胚根的伸长有抑制作用。当GhNPC3a的表达水平过高时，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinases inhibitor，CKI)家族基因表达上调而细胞周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases，CDK)家族基因表达下调，棉花种子的细胞分裂速率下降，影响了胚轴和胚根的伸长;与此同时，一些细胞壁水解酶基因和扩展蛋白基因的表达下调，从而减缓细胞壁的松弛，制约了胚轴和胚根伸长。Small Auxin-Up RNA(SAUR)和Gretchen-Hagen3(GH3)在下胚轴伸长过程中有重要作用，转录组分析结果表明过表达GhNPC3a基因也可能通过影响SAUR和GH3的表达来影响棉花胚轴的伸长。过表达GhNPC3a基因还可能通过影响WUS-CLV反馈调节途径来抑制干细胞的分化，从而使胚根和胚轴不能正常伸长。在萌发异常的过表达GhNPC3a的棉花种子中，乙醛酸循环体ABC转运蛋白基因CTS/PED3/PXA1的表达下调可能导致TAG水解产生的脂肪酸不能有效地进入乙醛酸循环体进行β氧化，以致不能有效地转化为种子萌发所需的蔗糖，造成胚轴和胚根不能正常生长。
综上所述，通过对棉花NPC基因家族的系统分析和GhNPC3a的初步功能研究，发现GhNPC基因家族可能参与ABA信号转导和植物非生物胁迫应答过程。GhNPC3a是非特异性磷脂酶C的旁系同源物，具有溶血磷脂酸磷酸酶活性，能够在细胞质中水解LPA产生MAG。产生的MAG可在MGAT的作用下转化为DAG，DAG在DGAT的作用下转化为TAG。过表达GhNPC3a基因棉花种子可通过这条不依赖PA的TAG合成途径促进TAG的合成，使棉花种子中52:7-TAG、53:1-TAG、54:5-TAG、56:6-TAG和58:9-TAG的含量显著增加;过表达GhNPC3a基因还会影响种子成熟过程中和萌发阶段的激素含量，不仅显著降低了棉花种子的萌发率，而且对萌发种子胚轴和胚根的伸长产生了显著影响，即在一定范围内过表达GhNPC3a基因促进了胚轴和胚根的伸长，但GhNPC3a表达水平过高对胚轴和胚根的伸长有抑制作用。本工作加深了对植物非特异性磷脂酶C基因家族的认识，为进一步探索GhNPC家族基因功能奠定了基础。