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钙依赖蛋白激酶(CDPKs)是一个重要的蛋白激酶家族,在植物响应生物和非生物胁迫中起重要作用。拟南芥CDPKs家族中共有34个成员,其中AtCDPK1和AtCDPKla高度同源。已有的研究结果表明,二者具有相似的功能。基于RNAi技术在基因功能研究中日的性强、周期短的特点,本文利用RNAi技术对AtCDPKl和AtCDPKla基因进行沉默,并对获得的拟南芥转基因纯合体植株的沉默程度进行了检测,结果如下:
1、针对拟南芥AtCDPKI和AtCDPKla基因构建了5个RNAi表达载体,其中共沉默RNAi表达载体3个、单一基因沉默的RNAi表达载体各1个。通过蘸花法将其分别转入野生型拟南芥Col-0,获得2个共沉默转基因纯合体和沉默了CDPKla基因的转基因纯合体;尚有1个共沉默转基因株系和沉默了CDPK1基因的转基因株系已进入T2代筛选。
2、用半定量RT-PCR检测转基因纯合体植株中目的基因沉默程度的结粜表明:
(1) CDPK-a的6个株系中两个日的基因的沉默程度都很强。其中,转基因植株10-2的AtCDPK,和AtCDPKla两个基因的沉默程度最强。
(2) CDPK-c的5个株系中AtCDPKla的沉默程度比ALCDPKI强。其中,沉默程度最强的是转基因植株2-2。
(3) CDPKla-2的9个株系中对日的基因AtCDPKla的沉默程度都较强。
其中株系29-4和36-5的沉默程度更强。
3、用半定量RT-PCR检测了转基因纯合体CDPKla-2的基因沉默特异性,结果表明9个株系都有较高的沉默特异性。