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研究背景正常肝脏在各种慢性肝病损伤下,引起持续或反复的肝实质炎症坏死,使得纤维结缔组织大量增生,而其降解相对不足,大量细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积形成肝纤维化,进一步进展则导致肝硬化的发生。如果能给予有效的治疗,则已经形成的肝纤维化可以逆转。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)由静息态被激活是肝纤维化的关键环节和细胞学基础,活化的HSC能合成和分泌ECM,导致ECM在肝内过量沉积。转化生长因子β1(transforming growth factor beta1, TGFβ1)能够促进HSC转变为肌成纤维样细胞,增加细胞外基质的产生,减少基质的降减,并抑制肝细胞再生及诱导凋亡在肝纤维化的发生中起到重要作用,被认为是目前最强的致纤维化因子。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin-like growth factor binding protein related protein1,IGFBPrP1)是一种可溶性的分泌性蛋白质。导师刘立新前期研究发现,IGFBPrP1在肝纤维化和肝硬化患者肝组织中高表达,并且与TGFβ11的高表达和胶原合成的增多呈正相关；外源性重组TGFβ1作用于体外培养的HSC后,可使IGFBPrP1蛋白的产生增多；抗IGFBPrP1抗体可以抑制TAA诱导的肝纤维化小鼠肝组织中TGFβ1的产生。有研究表明,0.05-0.1μg/L浓度的外源性重组TGFβ1作用于兔角膜内皮细胞时,可以促进细胞的增殖,内源性TGFβ1基因在兔角膜内皮细胞中过表达后,细胞增殖受到抑制,提示不同来源的TGFβ1对同一细胞的生理作用会有不同的影响。为了明确内源性TGFβ1对肝星状细胞中IGFBPrP1表达的影响及其可能的意义,设计了本课题。目的明确内源性转化生长因子(TGF)β1对肝星状细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)表达的影响及其可能的意义。方法1.转染效率检测使用带荧光的阴性质粒pEGFP-N1转染人肝星状细胞LX-2后48h,荧光显微镜下观察转染效率。2.内源性TGFβ1基因过表达将LX-2分为3组：空白对照组：加入等量不含血清及抗生素的RPMI-1640培养液；阴性质粒组：转染阴性对照质粒；TGFβ1过表达组：转染TGFβ1过表达质粒。转染后不同时间(24h、48h、72h),采用Real-time PCR法检测TGFβ1、Collagen I mRNA的表达；转染后72h,采用Western blot法检测细胞上清液中TGFβ1、Collagen I蛋白的表达。3.内源性TGFβ1对IGFBPrPl表达的影响LX-2分组及处理同前,转染后不同时间(24h、48h、72h),采用Real-time PCR法检测IGFBPrP1mRNA的表达；转染后72h,采用Western blot法检测细胞胞浆中IGFBPrP1蛋白的表达。结果1.细胞转染效率转染后48h,荧光显微镜下观察,可见绿色荧光,说明转染成功,计算质粒转染效率达40%。2.TGFβ1、Collagen I mRNA及蛋白的表达Real-time PCR检测结果显示：转染后24h,TGFβ1过表达组(32.22±0.39)TGFβ1mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(7.98±0.12),异有统计学意义(P<0.01),TGFβ1过表达组(1.92±0.04)Collagen I mRNA的表达与阴性质粒组(1.99±0.07)别不明显(P>0.05)；转染后48h, TGFβ1过表达组(63.12±0.44)TGFβ1mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(1.01±0.01),TGFβ1过表达组(2.00±0.06)Collagen I mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(1.02±0.01),差异均有统计学意义(P值均<0.01)；转染后72h, TGFβ1过表达组(38.46±0.19)TGFβ1mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(1.05±0.01),TGFβ1过表达组(8.63±0.15)Collagen I mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(1.03±0.02),差异均有统计学意义(P值均<0.01)。Western blot检测结果显示：转染后72h, TGFβ1过表达组(0.27±0.04)TGFβ1蛋白的表达明显高于空白对照组(0.20±0.01)及阴性质粒组(0.22±0.01),TGFβ1过表达组(1.47±0.02)Collagen I蛋白的表达明显高于空白对照组(0.76±0.03)及阴性质粒组(0.77±0.02),差异均有统计学意义(P值均<0.05)。3. IGFBPrPl mRNA及蛋白的表达Real-time PCR检测结果显示：转染后24h, TGFβ1过表达组(4.33±0.38)IGFBPrP1mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(2.86±0.09)；转染后48h, TGFβ1过表达组(1.41±0.11)IGFBPrP1mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(1.07±0.16)；转染后72h, TGFβ1过表达组(2.56±0.30)IGFBPrPl mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(1.00±0.10),差异均有统计学意义(P值均<0.01)。Western blot检测结果显示：转染后72h,TGFβ1过表达组(0.53±0.01)IGFBPrPl蛋白的表达明显高于空白对照组(0.25±0.02)及阴性质粒组(0.27±0.03),差异有统计学意义(P<0.05)。结论内源性TGFβ1可引起LX-2过表达TGFβ1和Collagen I mRNA及蛋白,同时亦可以增加IGFBPrP1mRNA及蛋白的表达。推测IGFBPrP1与致肝纤维化最强的因子TGFβ1之间密切相关,在肝纤维化的发生发展中起重要作用。