论文部分内容阅读
目的：探讨TGF-β1信号通路与相关差异性microRNAs (miRNAs)在人横纹肌肉瘤(RMS)肌源性分化调节中的作用。方法：(1)用TGF-β1-siRNA分别处理RMS细胞株RD, SMS-CTR和RH28细胞，利用miRNA芯片聚类分析RMS细胞株中TGF-β1相关miRNAs的表达图谱。采用免疫组织化学染色和RT-PCR分别检测RMS组织(该组织中TGF-β1高表达或低表达)中相关miRNAs的表达。并针对TGF-β1高表达或低表达的RMS组织，采用Westernblot、 Northern blot和RT-PCR法验证筛选出的最有效TGF-β1相关差异性miR-450b-5p。(2)将筛选出的miRNA (miR-450b-5p)-成熟体(mimics, M)或抑制子(inhibitors, I)体外瞬转到人胚胎型横纹肌肉瘤(ERMS) RD细胞和腺泡型横纹肌肉瘤(ARMS) RH28细胞中，采用RT-PCR法检测miR-450b-5p的表达。采用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法和MTT法检测转染后RD和RH28细胞的增殖情况。采用免疫荧光染色法检测转染后RD细胞的Caspase-3和TUNEL，观察细胞凋亡情况。(3)将RD细胞接种到裸鼠用于体内实验，瘤内注射M或I后，采用体积测量初步估计M或I对致瘤性的影响。采用免疫组织化学法对M处理的皮下RD组织染色检测其Ki67、肌形成蛋白、肌球蛋白和结蛋白表达。采用RT-PCR法验证M对皮下RD组织肌源性分化的作用。(4)通过Target Scan6.1, Diana microT4.0和MICRORNA.ORG生物信息软件筛选出miR-450b-5p的预期靶点。采用TGF-β1-siRNA使各RMS细胞(ERMS:RD, RH36, SMS-CTR; ARMS: RH30, RH28, RH3)中的miR-450b-5p过表达，RT-PCR和Western blot法检测并筛选有效靶点。用靶点的野生型/突变型-报告基因(Wt.UTR/Mut.UTR)和M/I共转染RD细胞，采用荧光素酶检测miR-450b-5p的功能性靶点，采用RT-PCR检测TGF-β1, miR-450b-5p及其靶基因在临床上的相关性。将M和靶基因-siRNA共转染入RD细胞，采用RT-PCR检测其mRNA表达水平，采用免疫荧光染色法检测TUNEL细胞凋亡情况和MHC表达。(5)用TGF-β1-siRNA处理RMS (RD和RH28)细胞，采用RT-PCR检测细胞中miR-450b-5p前体和成熟miR-450b-5p的表达。用TGF-β1-siRNA, Smad4-siRNA, Smad2-siRNA和Smad3-siRNA转染RD细胞，同时结合外源性TGF-β1处理，采用RT-PCR检测miR-450b-5p表达水平。用TGF-β1-siRNA, Smad4-siRNA, Smad2-siRNA, Smad3-siRNA和靶基因Wt.UTR/Mut.UTR共转染RD细胞，采用荧光素酶检测靶基因信号。结果：(1) miRNA芯片结果显示，TGF-β1-siRNA处理的RMS细胞株中5个miRNA(miR-4275, miRNA-4298, miR-411, miR-493*and miR-450b-5p)过表达，只有miR-2113的表达显著下调；免疫组织化学和RT-PCR检测发现TGF-β1低表达的RMS组织中miR-450b-5p的过表达最为显著，并通过Western blot、Northern blot和RT-PCR得到验证。(2) RT-PCR结果显示，M显著增加了miR-450b-5p的表达，I显著抑制了miR-450b-5p的表达；3H-TdR渗入法和MTT法结果显示，经M转染的RMS细胞增殖能力随时间梯度递降；免疫荧光染色法结果显示，经M转染后Caspase-3和TUNEL阳性细胞数显著增加，TGF-β1-siRNA与M共转促进了细胞的凋亡。(3)肿瘤体积测量结果显示，M组肿瘤增长速度随时间递减，3周以后有显著差异；免疫组织化学法结果显示，M组肌形成蛋白和肌球蛋白显著增加；RT-PCR结果显示，M组和M+TGF-β1组肌形成蛋白和肌球蛋白增加，且M组显著增加。(4)基因敲除这些靶点中只有ENOX2和PAX9被抑制，RT-PCR和Western blot结果显示M组ENOX2和PAX9表达下调，而I组表达上调；荧光素酶分析表明，RD细胞中ENOX2和PAX9的野生型3’-UTR序列的活性在miR-450b-5p成熟体共转后减弱，而在miR-450b-5p抑制子共转后增强；RT-PCR显示ENOX2和PAX9的高表达与miR-450b-5p的低表达、TGF-β1的高表达相关；免疫荧光染色结果显示，经ENOX2-siRNA和PAX9-siRNA分别与M共转染RD细胞后TUNEL和MHC显著增加。(5) RT-PCR结果显示，TGF-β1-siRNA处理的RD和RH28细胞中miR-450b-5p前体和成熟miR-450b-5p表达量增加，且成熟miR-450b-5p表达量显著增加；TGF-β1-siRNA, Smad4-siRNA和Smad3-siRNA转染RD细胞后miR-450b-5p表达显著增加，而外源性的TGF-β1使其表达显著减少，只有Smad2-siRNA组都没有；荧光素酶检测结果显示，经TGF-β1-siRNA, Smad4-siRNA和Smad3-siRNA转染RD细胞中ENOX2和PAX9信号减弱，而Smad2-敲除RD细胞中没有。结论：(1)通过miRNA芯片,免疫组织化学, RT-PCR, Western blot和Northern blot成功筛选出miR-450b-5p作为一个抗肿瘤调节因子进行后续实验研究。(2) M显著增加miR-450b-5p的表达，抑制RMS细胞活性，并促进其凋亡，且与TGF-β1-siRNA共转染进一步加快细胞的凋亡。(3) M抑制了RMS细胞的致瘤性，而TGF-β1阻抑M在RMS组织的诱导分化效应。(4) ENOX2和PAX9是miR-450b-5p功能性分化调节靶点，有3’-UTR序列活性，与miR-450b-5p负相关、TGF-β1正相关。(5) miR-450b-5p通过TGF-β1的抑制作用发生在后转录水平，Smad3与Smad4主要参与了miR-450b-5p的表达调控，而Smad2没有。