一、背景和目的在肝胆外科临床中,胆管梗阻、胆汁淤积是常见的病理环境,较长时间梗阻,可诱发永久性肝损害,甚至发展成肝纤维化及肝硬化,是临床治疗的难题,相关发病机制基础研究有现实意义。现已发现人类慢性肝病组织如肝硬化、亚急性肝坏死后肝再生、儿童先天性肝外胆管闭锁、遗传性血色病、慢性病毒性肝炎、原发性肝癌中都存在类似于卵圆细胞的肝前体细胞。这种肝前体细胞定位于汇管区、纤维间隔、汇管区旁肝实质、假小叶及炎症边界。随着肝脏卵圆细胞特异性标记物的发现,卵圆细胞相关研究成为热点,特别是肝脏卵圆细胞参与肝脏损伤修复、肝脏纤维化的相关研究。另外有研究证明多种组织器官的纤维化进程中伴随着胚胎发育相关基因及多种细胞因子的重新激活。这些为研究肝脏损伤的保护、治疗及肝纤维化的形成机制提供了最新途径。因此,本研究通过结扎Wistar大鼠胆总管,模拟胆管梗阻病理状态,通过免疫组化、PCR技术,探讨这一病理过程相关细胞因子和肝脏卵圆细胞在胆管梗阻肝脏纤维化过程中发挥的作用。二、材料与方法雄性Wistar大鼠60只,体重250-300克,健康,无明显畸形,将动物随机分成两组,一组(30只)作为实验组实施近肝门端胆总管单线结扎(BDL术)；另一组(30只)作为对照组实施假手术,开腹游离胆总管但不结扎。术后相同条件下饲养。分别于术后第1天、2天、3天、7天、14天、21天处死大鼠,每组各处死5只,取肝右叶应用4%多聚甲醛固定,留作免疫组化；取肝左叶-80℃冻存,留作RT-PCR检测。1、通过肉眼及HE染色观察胆管梗阻不同时间点肝脏形态改变。2、通过免疫组化,0V-6标记卵圆细胞,观察不同时间点卵圆细胞的数目、分布。3、通过PCR检测各目的基因：转化生长因子(TGF-β1、TGF-α),肝细胞生长因子(HGF),胶原蛋白Ⅰ(COLⅠ),观察不同时间点各基因的表达情况。三、结果1、大体结果Wistar大鼠胆管梗阻后可见肝脏黄染并肿胀,肝脏淤血、水肿。福尔马林固定后部分大鼠的肝叶标本,可见表面粗糙,颜色灰白等肝组织早期肝纤维化的表现。对照组：肝脏标本各肝叶色泽红润,表面光滑。2、HE染色结果：术后第1天见少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润；术后第2天少许新增生无管腔的小胆管,少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润；术后第3天新增生的细小胆管和无管腔的小胆管,嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润较术后第2天明显增加,肝细胞轻度变性,可见灶状和片状坏死,肝组织汇管区可见胆管增生和纤维组织细胞增生,偶见胆管扩张；术后第7天肝细胞出现变性坏死发生率增加及程度加重,重者见片状出血和坏死,肝组织门区可见胆管增生和纤维细胞增生;术后14天小叶结构受到破坏,可见肝细胞空泡变性及坏死：术后21天小叶结构破坏更加严重,大量肝细胞坏死。随时间进展肝脏损伤、纤维化程度逐渐加重。3、免疫组化结果0V-6免疫组化阳性染色的细胞数目及分布范围随着梗阻时间的延长而增加,实验组和对照组有明显差异。0V-6阳性细胞表达部位主要位于汇管区胆管及肝间质新增生胆管及无管腔的小胆管细胞胞浆中。4、RT-PCR结果在对照组和BDL组大鼠肝脏中均能检测出目的基因的表达。统计分析显示两组TGF-β1, COL I的表达差异从第1天开始有统计学意义,BDL组与对照组中HGF及TGF-α的表达差异从第3天开始有统计学意义。对BDL不同天数组间的表达研究发现COL I, TGF-β1在3-7天无统计学意义,HGF在13天、7-21天,TGF-α在12、7-21天无统计学意义,而其他相邻各组间均有统计学意义,COL I、TGF-β1指标13天增长趋势最明显,TGF-β、HGF指标3-7天增长趋势最明显。四、结论1、研究发现肝外胆管结扎造成胆管梗阻的大鼠模型,其肝脏呈现胆汁淤积性、进行性加重的纤维化表现。卵圆细胞参与胆管梗阻后损伤的修复过程,其时序性变化趋势与抗肝脏纤维化的细胞因子变化趋势相似,可能参与抗纤维化过程。2、研究发现实验组肝脏纤维化相关基因表达明显高于对照组,并且随着梗阻天数的增加表达量增加,其中COLⅠ可显示纤维化的进程,TGF-β1与促进肝脏纤维化过程有关,TGF-α、HGF与对抗肝脏纤维化过程有关。3、研究发现在肝纤维化过程中的3-7天是纤维化过程的特殊时期,第3天之前以促纤维化过程为主要表现；第3天开始出现抗纤维化表现,促纤维化趋势减弱,纤维化速度减慢；第7天之后为持续的的肝脏纤维化进程。