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一、菌根真菌在金线莲栽培中应用及其共生机理研究福建金线莲Anoectochillus roxburghii(AR)和台湾金线莲A.formosanus(AF)同属兰科开唇兰属濒危药用植物.在自然条件下兰科植物常与真菌形成互惠互利的共生关系.据此,将菌根真菌AR-15和AR-18接种到无菌状态下生长在蛭石基质上的福建金线莲组培苗根部,发现接菌处理对其鲜重的增加有极显著促进作用(P<0.01),提高69.3%(AR-15)和74%(AR-18);对其苗高也有极显著影响(P<0.01),分别提高33.99%和31.1%.因此在福建金线莲和台湾金线莲的人工栽培中,利用菌根真菌AR-18实现了两种金线莲的人工栽培.为了进一步说明菌根真菌对两种金线莲生长的影响,我们将两种金线莲种入花盆中.结果显示福建金线莲接种18号菌根真菌后鲜重和干重比对照分别提高45.3%和21.7%.台湾金线莲分别提高40.4%和26.2%.同时测定了两种金线莲果糖、蔗糖、多糖和可溶性总糖的含量.结果表明这四种干物质的含量较不接菌的对照组相比均不同程度地得以提高.十一种无机元素中铬和铁的吸收增加,对其它九种元素的影响随金线莲种类和栽培基质不同而变化.为从生化角度了解菌根真菌促进两种金线莲生长的原因,我们测定了几丁质内切酶酶活、几丁质外切酶酶活、β-1,3-葡聚糖酶酶活、多酚氧化酶酶活和苯丙氨酸解氨酶的酶活.结果栽培在草炭土基质中的台湾金线莲接菌处理后酶活为对照的1.13倍-1.29倍;而福建金线莲酶活为对照的1.03倍-1.52倍.在蛭石基质上,菌根真菌对四种酶活的影响比草炭土大.如对台湾金线莲来说,这四种酶活为对照的1.27倍-1.72倍.对福建金线莲来说也是蛭石基质上的影响大,四种酶活为对照的1.17倍-1.84倍.所以在不同基质中这四种酶的酶活在AR-18号真菌处理的两种金线莲中均不同程度地被提高,而这四种酶本身与提高植物抗性有关.为了寻找菌根真菌促进金线莲生长的分子机理,采用CTAB法从富含多糖和酚类物质的福建金线莲中提取出高质量的RNA作为模板,利用mRNA差异显示技术的优化方法,如银染变性聚丙烯酰胺凝胶,地高辛标记反向Northern的两个cDNA探针,优化PCR扩增程序等,分离到差异表达的七个阳性片段.从基因表达水平来说,五个在接菌处理后表达水平上调,一个表达受抑制,一个为菌刺激特异表达.测序后进行同源性比较,两个为已知基因,五个为未知基因.二、粉尘螨和黑麦草变应原决定簇及全长基因的克隆与表达粉尘螨和黑麦草花粉是两类比较重要的变应原,它们引发许多人的IgE介导的免疫反应,出现过敏性鼻炎、哮喘和花粉热病等临床变态反应症状.现阶段对过敏反应的治疗除服用抗组胺药外,还采用变应原进行免疫治疗.近年来许多变应原的基因已被克隆,这对于深入了解过敏反应机制起重要作用.标准化的重组过敏原对致敏原性的评估也十分重要.寻找变应原决定簇可以用以指导变应原的改造,以降低致敏活性,更安全更有效地用于免疫治疗.我们通过PCR途径获得了两种致敏原的cDNA克隆.它们分别编码粉尘螨DerfⅡ(67-90aa)(简化为M)和黑麦草lolp5(49-60aa)(简化为A).将它们构建到原核表达载体pGEX-KG中,在大肠杆菌BL21中得到了高效表达.采用亲和层析的办法对表达的融合蛋白GST-M和GST-A进行纯化,纯度高达90%以上.用纯化的蛋白与病人阳性血清IgE反应,结果GST-M无过敏活性,GST-A有IgE结合活性.利用PCR技术从粉尘螨和黑麦草基因组中扩增到560bp的DerfⅡ全长和980bp的lolp5全长,并构建成原核表达载体pBV220-DerfⅡ和pBV220-lolp5,在大肠杆菌中得到了表达.为了研究致敏性蛋白在转基因植物中致敏原性的变化和转基因植物中过敏性评估方法的标准化,我们构建了表达上述两种致敏原的双元表达载体p3301-BI121-DerfⅡ和p3301-BI121-lolp5,并将其导入烟草中.通过RNA干涉的技术降低过敏原的免疫原性,将黑麦草花粉过敏原的反义基因构建到双元表达载体p3301-BI121中,以期在RNA水平抑制花粉过敏原的表达.在农杆菌介导下对烟草进行转化,通过GUS染色和PCR方法鉴定DerfⅡ的阳性植株.结果得到21株转DerfⅡ基因的阳性植株.ELISA证明转基因烟草具有病人血清IgE结合活性,但比起粉尘螨粗提液的活性却降低了许多.对于黑麦草基因的烟草转化工作,目前已得到分化植株.