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创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是常见的致死、致残性疾病,损伤后可出现认知记忆障碍、行为异常等变化,是目前影响人类健康的世界性难题。随着我国经济与交通的快速发展,创伤性脑损伤的发生率也同比增加。尽管创伤性脑损伤的救治体系和方案不断完善,但其死残率仍居高不下。而目前创伤性脑损伤的损伤机制仍不清楚,因此,进一步深入研究创伤性脑损伤的病理分子机制将成为神经外科领域的研究重点。近来,自噬(Autophagy)作为神经细胞另一种程序性死亡方式越来越受到关注,但其具体机制尚不清楚。自噬是通过溶酶体机制和微管系统等共同作用的一种代谢途径。它在神经元中起清除和再利用细胞成分的作用,并参与多种病理生理过程。创伤性脑损伤后,启动自噬可保护受伤的神经细胞,避免其趋向死亡,及时清除已损害的细胞、毒性兴奋性氨基酸、自由基及代谢废物等,对损伤后或应激状态下神经细胞的存活起着重要的作用。雷帕霉素(Rapamycin)是经典的mTOR受体抑制剂,通过特异地抑制mTORC1从而介导下游自噬信号途径的激活,其中,mTOR受体在自噬的调节中起关键作用。近年来,雷帕霉素激动自噬在神经细胞损伤后的保护作用也逐渐被人们认识并引起重视。在本研究中,(一)、应用大鼠侧方液压脑损伤模型,伤后6周大鼠空间记忆功能出现障碍,损伤侧海马组织自噬相关蛋白明显减少；(二)、给予自噬激动剂雷帕霉素后,TBI后6周,大鼠空间记忆功能改善；(三)、TBI后应用雷帕霉素大鼠损伤侧海马组织自噬增强,神经细胞凋亡抑制。第一部分中型创伤性脑损伤后大鼠空间记忆功能和自噬变化一、目的：(1)构建中型侧方液压脑打击损伤大鼠模型；(2)验证TBI后大鼠认知空间记忆的改变；(3)观察TBI后大鼠损伤侧海马组织自噬变化；二、材料和方法：1、成年雄性SD大鼠,体重(190±15)g,饲养3周后,体重为(350±20)g,大鼠行开颅钻孔手术,钻孔中心位于前囟后4.5mm,中线旁开左侧3mm,钻孔直径0.5cm,切开头皮,移除骨窗,避免损伤硬膜,采用磷酸锌水门汀齿科固定材料固定液压打击处,连接液压打击仪,给予2.12±0.03倍大气压强度打击；假手术对照组(Sham)只切开皮肤,钻孔后缝合。伤后每日记录大鼠体重并描绘变化曲线,对于体重减轻超过体重50%以上或感染严重或濒死的大鼠,退出实验。2、成年雄性SD大鼠25只,按照随机数字表法分为TBI组,数量为15只；假手术组(Sham),数量为10只。3、伤后6周,第36-40天行Morris水迷宫测试,训练总天数为5天,分为空间记忆定位测试、空间探索功能测试两部分,主要检测大鼠损伤后短期记忆及空间探索能力,用于评估TBI后大鼠学习和记忆存储功能变化。4、行为学测试最后一天(伤后40天),分别随机抽取不同组别大鼠,待麻醉满意后,迅速断头,冰上取损伤侧海马组织(30s内),进一步提取总蛋白并检测。配置体积分数为15%分离胶,行SDS-PAGE电泳,湿转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,放入封闭液中封闭,后将PVDF膜放入分别含一抗内参p-actin (1:5000)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)(1：1000)、自噬相关蛋白Beclin-1 (1：500)杂交袋中,置于4。摇床过夜,用PBST洗膜3次,每次5 min,后孵育结合荧光二抗1.5 h,再次避光洗膜3次后荧光扫膜显色。观察自噬相关蛋白表达差异。三、结果：1、Morris水迷宫数据提示中型创伤性脑损伤可导致大鼠空间记忆功能障碍(p<0.05)。水迷宫实验第5天,TBI组与Sham组相比,潜伏期P(入水至找到逃生平台所需时间)明显缩短(P<0.05)。空间探索测试结果提示,TBI组较假手术组在目标象限滞留时间明显缩短(P<0.05),表现出区域偏好性差或不存在。2、Western-blot结果提示,伤后6周,TBI组与Sham组比较,损伤侧海马组织自噬蛋白Beclin-1和LC3出现明显下降(P<0.05)。四、结论：1、中度TBI后,大鼠海马结构出现损伤,伴随空间记忆功能障碍；2、损伤侧海马组织在TBI后期(损伤后40天)自噬减弱。第二部分雷帕霉素诱导自噬对中型创伤性脑损伤大鼠认知功能的影响目的：通过mTORCl受体抑制剂雷帕霉素,诱导损伤侧海马组织自噬增强,观察大鼠空间记忆功能变化。材料和方法：应用成年雄性SD大鼠中型创伤性脑损伤模型,方法同前。雄性成年SD大鼠84只,体重(190±15g),饲养3周后,体重为(350±20)g,准备工作同前,84只大鼠按照随机数字表法分为6组：第1组(CTR+DMSO组,数量=12)；第2组(CTR+Rapamycin组1.5 mg/kg,数量=13)；第3组(Sham+DMSO组,数量=12)；第4组(Sham+Rapamycin组1.5 mg/kg,数量=12)；第5组(TBI+DMSO组,数量=18)；第6组(TBI+Rapamycin组1.5mg/kg,数量=17)。给药方式：TBI后30min内为首次给药时间,后连续2周间隔24小时给药。TBI后第36-40天行Morris水迷宫测试,方法同前。结果Morris水迷宫数据证明：大鼠TBI后,Rapmycin组比较DMSO组,潜伏期P明显缩短(13.82s VS 6.0s, P<0.05); DMSO组则出现明显的空间记忆功能障碍(19.75s VS 7.75s,P<0.05)；而Sham组与CTR组比较无统计学意义(6.75s VS7.5s,P>0.05)。结论给予雷帕霉素激动自噬后,大鼠空间记忆功能得到改善；第三部分雷帕霉素对中型创伤性脑损伤大鼠海马CA3区神经细胞自噬与凋亡的影响目的：通过mTORC1受体抑制剂雷帕霉素诱导损伤侧海马组织自噬增强,观察海马CA3区神经细胞自噬与凋亡变化。材料和方法：行为学测试最后一天(伤后40天),按照随机数字表法抽取大鼠(TBI+Rapmycin)组8只,(TBI+DMSO)组9只,(Sham+Rapmycin)组6只,(Sham+DMSO)组6只,(CTR+Rapmycin)组6只,(CTR+DMSO)组6只,麻醉后断头取损伤侧海马组织行Western-blot检测自噬变化,方法同前；剩余大鼠则提取完整脑组织,经4%多聚甲醛固定后经石蜡包埋,自前囟后2.31mm至前囟后4.9mm连续冠状切片,厚度设定为4μ m。脑组织观察区域限定为损伤同侧脑组织海马结构(CA3)区。通过免疫组化、免疫荧光以及凋亡TUNEL观察不同组别损伤侧海马组织CA3区损伤后期神经细胞自噬水平及凋亡细胞数量差异。结果1、Western-blot、免疫组化及免疫荧光结果提示中度TBI后6周,损伤侧海马组织自噬水平明显下降(P<0.01),雷帕霉素治疗组可提升损伤侧海马组织自噬水平。证明了本课题所选择治疗剂量、给药方式及治疗时间窗效果肯定；2、Western-blot及免疫组化、免疫荧光、TUNEL凋亡检测提示：(TBI+Rapmycin)组损伤侧海马组织自噬明显增强,且神经细胞凋亡抑制,海马CA3区神经细胞凋亡数目减少(P<0.05)。结论损伤后雷帕霉素可通过增强自噬,减低损伤侧海马组织凋亡水平,抑制海马CA3区神经细胞凋亡而起到脑保护作用。