【摘 要】
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猪瘟是一种由猪感染了猪瘟病毒（Classic swine fever virus,CSFV）所引起的急性、高度致死性烈性传染病。猪瘟在我国发生和流行,给养猪业造成严重危害。疫苗接种是预防猪瘟的有效途径。我国现行用于预防猪瘟的减毒活疫苗为猪瘟兔化弱毒株（Hog Cholera Lapinized Virus,HCLV）,简称猪瘟疫苗C株,是上世纪50年代我国科研人员将CSFV强毒石门（Shimen）
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猪瘟是一种由猪感染了猪瘟病毒（Classic swine fever virus,CSFV）所引起的急性、高度致死性烈性传染病。猪瘟在我国发生和流行,给养猪业造成严重危害。疫苗接种是预防猪瘟的有效途径。我国现行用于预防猪瘟的减毒活疫苗为猪瘟兔化弱毒株（Hog Cholera Lapinized Virus,HCLV）,简称猪瘟疫苗C株,是上世纪50年代我国科研人员将CSFV强毒石门（Shimen）株在兔体中连续传代后适应获得。本论文研究了猪瘟疫苗C株E2基因和基因组3’非编码区在决定CSFV复制效率和致病性中的作用,旨在揭示猪瘟疫苗C株减毒的分子机制,为研发猪瘟新型疫苗提供新思路。主要研究成果包括：（1）以CSFV Shimen株基因组RNA为模板,特异引物RT-PCR扩增病毒基因组cDNA片段,将PCR扩增片段依次克隆连接到质粒载体pACNR1180中,构建基因组全长cDNA克隆pSM。将pSM线性化,体外转录得到CSFV的基因组vRNA,将vRNA转染至PK15细胞,成功拯救出具有感染性的猪瘟病毒（vSM）。拯救产生的vSM与野生型猪瘟病毒（wtSM）在PK15细胞上具有相同的增殖特性。（2）基于CSFV Shimen株感染性cDNA克隆反向遗传操作,将猪瘟疫苗C株E2基因和3’UTR分别或同时替换Shimen株基因组的对应序列,构建了嵌合病毒感染性克隆pSM/CE2、pSM/C3’UTR和pSM/CE2/3’UTR,并拯救得到了嵌合病毒vSM/CE2, vSM/C3’UTR和vSM/CE2/3’UTR。与亲本病毒vSM相比,嵌合病毒vSM/CE2在细胞上的复制效率和形成蚀斑能力降低：嵌合病毒vSM/C3’UTR细胞生长特性略有改变；嵌合病毒vSM/CE2/3’UTR在细胞上的复制效率和形成蚀斑的能力显著降低,表明猪瘟疫苗C株E2和3’UTR对病毒复制有协同调节作用。用嵌合病毒vSM/CE2、 vSM/C3’UTR和vSM/CE2/3’UTR分别感染仔猪,所有组仔猪均存活,不表现任何猪瘟临床症状或者仅表现轻微的猪瘟临床症状。而感染亲本病毒vSM的仔猪均表现出典型急性猪瘟临床症状,所有猪在感染病毒11天内死亡。这些结果表明,嵌合病毒vSM/CE2、vSM/C3’UTR和vSM/CE2/3’UTR毒力减弱。（3）将嵌合病毒在PK15细胞上连续传代至第11代时,vSM/CE2-p11和vSM/CE2/3’UTR-pll在PK15细胞的复制效率比原代嵌合病毒升高约10倍；与原代嵌合病毒相比,vSM/CE2-p11形成更大的蚀斑,而vSM/C3’UTR-p11的复制效率和形成蚀斑能力没有改变。猪体实验结果表明,与原代嵌合病毒相比,vSM/CE2-p11和vSM/C3’UTR-pll对仔猪致病性明显增强,而vSM/E2/3’UTR-pll的致病性略有增强,但不足以导致仔猪死亡。（4）对病毒vSM/CE2-pll进行全基因组测序分析发现,E2基因出现氨基酸突变T745I和M979K。基于嵌合感染性克隆pSM/CE2反向遗传操作,构建了感染性克隆pSM/CE2/T745I、pSM/CE2/M979K和pSM/CE2/T745I;M979K,成功拯救突变体病毒vSM/CE2/T745I、vSM/CE2/M979K和vSM/CE2/T745I;M979K。与亲本病毒vSM/CE2相比,突变体病毒的增殖效率显著提高。猪体实验结果证实氨基酸突变T745I和M979K增强病毒vSM/CE2的致病性。（5）用具有减毒特性的重组嵌合病毒进行猪体免疫接种,于接种后第23天用CSFV强毒Shimen株攻毒感染,所有仔猪存活,均未表现出猪瘟临床症状。表明猪瘟疫苗C株E2和3’UTR替换构建的嵌合CSFV减毒株能够诱导完全抵抗CSFV强毒致死攻击的免疫保护。以上研究成果有助于更好的了解猪瘟疫苗C株减毒的分子机制并为开发新型猪瘟疫苗提供了有益的借鉴和参考。
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