论文部分内容阅读
生姜是药食同源的资源之一,鲜姜中的主要功能成分姜酚,是一系列具有相同的酚酮官能团,伴随不同C原子个数烷基侧链同系物的统称,具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种功能。铜陵白姜属于安徽省铜陵市地方品种,拥有独特的风味和成分。本论文针对铜陵白姜姜酚的提取、纯化、抗氧化能力和抗癌活性等方面开展了相应的研究,明确6-姜酚和10-姜酚诱导宫颈癌Hela细胞的凋亡机理,明确6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚之间的协同抗癌效果及6-姜酚和10-姜酚与紫杉醇、5-FU的协同抗癌作用。本论文的研究对于丰富姜酚的抗癌机理具有重要意义,为把铜陵白姜开发成特殊医学用途的配方食品,提供了理论依据。铜陵白姜姜酚提取条件优化及其分离鉴定。利用超声波辅助提取铜陵白姜姜酚的最优工艺条件为:提取时间53 min,提取温度47℃,液料比14:1和65%的乙醇,在此条件下姜酚得率为3.72 mg/g。姜酚粗提物经硅胶柱色谱技术配合高速逆流色谱技术纯化,得到纯度分别为90.91%、97.72%和90.06%的三个组分。经UPLCTOF-MS/MS技术和NMR技术鉴定,三种组分分别为6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚。三种姜酚的体外抗氧化活性比较。通过6项指标检测三种姜酚的抗氧化活性,均呈现浓度依赖性模式,浓度越高,抗氧化能力越强。随着侧链的延长,三种姜酚的还原能力、DPPH自由基的清除能力、ABTS+自由基的清除能力、羟基自由基的清除能力和超氧阴离子的清除能力逐渐降低,即6-姜酚>8-姜酚>10-姜酚;但是脂质抗氧化能力,却随着侧链的延长而升高,即10-姜酚>8-姜酚>6-姜酚。6-姜酚诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及其机理。6-姜酚可以有效抑制Hela细胞的增殖,其IC50和IC80分别为96.00μM和133.56μM。6-姜酚对细胞形态的损伤随着处理浓度的提高而加重;6-姜酚处理后,Hela细胞形态产生一定的改变,如细胞边缘凝结、细胞内陆续出现一定透明状气泡、个体缩小等现象。6-姜酚有效阻滞Hela细胞周期于G0/G1期,且细胞比例随6-姜酚处理浓度的增加和时间的延长而增加。6-姜酚可以有效降低Hela细胞Cyclin A和Cyclin D1基因的mRNA和蛋白表达水平;Cyclin B1基因的mRNA和蛋白表达水平并没有明显降低;Cyclin E1的mRNA下降明显,但其蛋白的表达水平降低不明显。6-姜酚主要通过调控Cyclin D1基因达到阻滞Hela细胞周期进程的效果。100μM的6-姜酚处理Hela细胞24 h、48 h和60 h后,细胞凋亡率分别为16.71%、33.00%和38.40%。6-姜酚处理Hela细胞后,Death Receptor信号通路中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达量均显著降低,相应的蛋白磷酸化水平显著上升;线粒体通路中Bcl-2蛋白表达量显著降低,Bax和细胞色素C的表达量升高;PI3K/AKT/AMPK/mTOR通路中p-PI3K、p-AKT、p-P70S6K和p-mTOR蛋白的表达量显著降低,p-AMPK蛋白表达显著上升。因此,6-姜酚通过调控Death Receptor信号通路、线粒体信号通路、PI3K/AKT/AMPK/mTOR信号通路中相关基因的表达,促进Hela细胞凋亡。10-姜酚诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及其机理。10-姜酚对Hela细胞增殖的抑制效果优于6-姜酚,IC50和IC80分别为29.19μM和50.87μM;10-姜酚对Hela细胞产生一定的细胞毒性,并伴随细胞形态的改变。10-姜酚有效诱导Hela细胞周期停滞在G0/G1期。10-姜酚处理后,G0/G1期的细胞比例随时间的延长而增加,6 h、12 h和18 h时分别为1.8%、9.8%和67.48%。10-姜酚有效降低Hela细胞Cyclin A和Cyclin D1基因的mRNA和蛋白表达水平,其变化量高于6-姜酚的处理效果;Cyclin B1基因的mRNA和蛋白表达水平并没有明显降低。10-姜酚主要通过调控Cyclin D1基因达到诱导Hela细胞周期阻滞的效果,同样在IC50浓度情况下,10-姜酚对Hela细胞周期的阻滞效果强于6-姜酚。10-姜酚可以显著上调Hela细胞Death Receptor信号通路中DR3和DR5蛋白的表达量,诱导Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白磷酸化激活,其中p-Caspase-8上升最为明显。10-姜酚可以下调线粒体信号通路中Bid、Bcl-2和Bad蛋白的表达量,显著上调Bax和细胞色素C的表达量。NF-kβ通路中PKCε和NF-kβ蛋白的表达量随10-姜酚处理浓度的递增均显著降低,分别相当于对照的0.61和0.64倍。10-姜酚有效抑制Hela细胞PI3K/AKT/AMPK/mTOR通路中PI3K蛋白的磷酸化,并引发其下游效应因子AKT和P70S6K蛋白的磷酸化降低,最终诱导p-mTOR蛋白表达量的降低,p-AMPK蛋白表达量的显著上升。因此,10-姜酚通过调控Death Receptor信号通路、线粒体信号通路、NF-kβ通路、PI3K/AKT/AMPK/mTOR信号通路中相关基因的表达,促进Hela细胞凋亡。姜酚同系物对宫颈癌Hela细胞的协同抑制作用。8-姜酚对Hela细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)为45.04μM,三种姜酚对宫颈癌Hela细胞增殖的抑制活性顺序为10-姜酚>8-姜酚>6-姜酚。6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的两两组合对Hela细胞的抑制效果不尽相同。6-姜酚+8-姜酚联合使用在较低的结合浓度下,具有明显的协同促进作用,但在高浓度条件下,协同效果不太明显;6-姜酚+10-姜酚联合处理Hela细胞,在较低浓度时表现为拮抗效果,在高浓度条件下,出现稳定的协同促进作用;8-姜酚+10-姜酚联合处理Hela细胞,呈现极为显著的协同促进作用。6-姜酚+5-FU联合处理Hela细胞,呈现良好的协同效果;6-姜酚+紫杉醇联合处理Hela细胞,呈现极为显著的协同抑制效果。10-姜酚+5-FU和紫杉醇的联合使用,协同效果明显。10-姜酚+5-FU的联合使用,在高浓度条件下,协同效果优于6-姜酚+5-FU联合使用的效果;10-姜酚+紫杉醇的联合使用,协同效果与6-姜酚+紫杉醇协同效果相似,并无明显差异。