百合花香单萜合成关键酶LiDXS基因的克隆与分析

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单萜类物质芳樟醇、(E)-β-罗勒烯、柠檬烯等是百合花香的重要组成成分,其生物合成是质体中的MEP合成途径完成的,该代谢途径上的关键酶和基因在模式植物中已有众多研究,但在百合中尚未见报道。为阐明百合花香单萜类物质的释放规律及其调控机制,本论文以浓香型百合‘西伯利亚’(Lilium’Siberia’)为材料,采用离体静态顶空吸附结合自动热脱附气质连用对单萜类物质的时空释放规律进行了研究,利用分子生物学方法,分离获得MEP合成途径的第一个关键酶基因,分析该基因的表达模式,并对其功能进行了验证。主要结果如下:1.单萜类物质的释放在‘西伯利亚’百合的花的不同组织及不同开花时期存在明显的释放规律。单萜类物质在花瓣中释放量较高;随开花进程单萜类物质释放量呈现先升高后降低的挥发模式,花蕾期较少,盛花期升高,衰弱期急剧下降。2.从浓香型百合‘西伯利亚’内轮花瓣中克隆出一个百合花香单萜关键酶基因,命名为LiDXS。该基因全长2479bp,开放阅读框为2199bp,编码732个氨基酸。通过氨基酸序列对比分析,DXS基因同源性在不同物种间较高,且包含两个高度保守的序列WDVGHM和IAENHA。对其进行系统进化树分析,百合LiDXS基因属于DXS2亚家族。3.通过在线WoLF POST预测,将LiDXS蛋白定位于叶绿体上。利用In-Fusion的方法构建融合植物表达载体:pSuper::LiDXS::GFP,通过农杆菌注射本生烟草叶片进行亚细胞定位实验,在激光共聚焦显微镜下观察定位于叶绿体上。4.荧光定量PCR表达结果显示,LiDXS基因在花瓣中特异高表达;在花开过程中,LiDXS基因的表达在整体上呈现先增高后降低的趋势,在盛花期最高。5.将LiDXS基因转入烟草中,利用固相微萃取技术对烟草花朵挥发物进行测定,发现转基因烟草的花中比野生烟草花中的芳樟醇含量显著升高,有显著差异,初步验证了LiDXS基因的功能,进一步证明LiDXS基因可能是百合花香单萜合成途径上的一个关键酶基因。本论文从’西伯利亚’中克隆一条花香单萜合成关键酶基因,并在植物体内对其功能进行验证,对百合花香单萜调控的分子机制有进一步了解,为百合花香育种提供一定依据。
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