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第一部分LncRNAZNRD1-AS1在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞侵袭转移的影响
背景：
胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，很容易发生侵袭转移，严重影响了患者的预后。尽管手术技术和靶向药物化疗水平不断提高，但由于许多患者在确诊时已伴有腹膜侵袭转移，5年生存率很低。研究表明长链非编码RNA(LongnoncodingRNA,lncRNA)在人类疾病中起关键作用，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等基本功能，近年来受到越来越多的关注。lncRNAZNRD1-AS1（以下简称ZNRD1-AS1）已被证实参与多种癌症的发生和发展，但目前国内外学者对ZNRD1-AS1在胃癌侵袭转移中的作用及其相关的调控机制缺乏系统的研究。本部分实验通过检测不同胃癌患者肿瘤组织中ZNRD1-AS1的表达情况，研究胃癌组织中ZNRD1-AS1的表达和ZNRD1-AS1对胃癌细胞侵袭转移的影响。
方法：
1.组织标本收集：收集2017年至2018年广州医科大学附属肿瘤医院确诊为转移性胃癌的患者胃癌组织标本。通过查阅文献分析，荧光定量PCR检测筛选出4个在胃癌转移中异常表达的lncRNA（PCBP1-AS1，RP6-24A23.7，ZNRD1-AS1，LINC00665），验证这4个lncRNA在胃癌及癌旁中的表达，分析筛选出最合适本项研究的lncRNAZNRD1-AS1，研究其在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞侵袭转移的影响。
2.细胞筛选：检测ZNRD1-AS1在胃癌细胞（3-5株）及人永生化正常胃上皮细胞GES-1中的表达，选择两株高表达的胃癌细胞进行后续的功能实验。
3.筛选ZNRD1-AS1的有效siRNA序列：采用荧光定量PCR方法检测用9组ZNRD1-AS1的siRNA瞬时转染的MGC803细胞，筛选出抑制效率最高的ZNRD1-AS1。
4.CCK8实验检测各组胃癌细胞si-ZNRD1-AS1的敏感性。
5.Transwell实验检测各组胃癌细胞的迁移侵袭能力。
6.westernblot检测各组胃癌细胞中的MMP2、MMP9、Vimentin和E-cadherin的蛋白水平表达情况。
结果：
在4个lncRNA（PCBP1-AS1，RP6-24A23.7，ZNRD1-AS1，LINC00665）中，相对于癌旁组织来说，ZNRD1-AS1在胃癌组织中显著高表达（P＜0.05）。研究发现，与BGC823+siNC组相比，BGC823+siZNRD1-AS1组的胃癌细胞增值率明显下降，迁移侵袭能力减弱，差异具有统计学意义（P＜0.05）；侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达均下调，E-cadherin蛋白表达上调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与MGC803+siNC组相比，MGC803+siZNRD1-AS1组的胃癌细胞增值率也明显下降，迁移侵袭能力减弱，差异具有统计学意义（P＜0.05）；侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达均下调，E-cadherin蛋白表达上调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。实验表明：抑制ZNRD1-AS1可以使胃癌细胞增殖率、迁移能力及侵袭能力明显下降，胃癌细胞凋亡率上升，细胞侵袭及转移相关蛋白表达水平下降，抑制细胞转移相关蛋白表达水平上升。
结论：
ZNRD1-AS1在发生转移的胃癌组织中异常高表达，可以促进胃癌细胞的增殖及侵袭转移。可能是潜在的胃癌侵袭转移肿瘤标志物。
第二部分lncRNAZNRD1-AS1通过miR-9-5p调控HSP90-P53结合促进胃癌侵袭转移
背景：
前面已研究证实ZNRD1-AS1在胃癌组织中表达水平显著升高，可促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。有研究发现MicroRNA-9-5p（miR-9-5p）在许多恶性肿瘤的发生发展进程中发挥作用。热休克蛋白90（HSP90）可通过调控HSP90-P53复合物形成，抑制P53的生物活性，调控胃癌细胞侵袭转移相关基因及多耐药基因的表达，促进胃癌侵袭转移。通过生物信息分析，我们发现ZNRD1-AS1可以与miR-9-5p结合调控HSP90的生物活性。本部分实验将通过生物信息学、荧光素酶实验研究ZNRD1-AS1与miR-9-5p、HSP90之间的关系，探讨其对胃癌细胞侵袭转移影响的机制。
方法：
1.ZNRD1-AS1和miR-9-5p的关系，荧光素酶活性检测ZNRD1-AS1和miR-9-5p结合位点，荧光定量PCR检测干扰ZNRD1-AS1后miR-9-5p的表达。
2.miR-9-5p和Hsp90的关系，荧光素酶活性检测miR-9-5p和Hsp90的结合位点过表达miR-9-5p，荧光定量PCR和westernblot检测Hsp90。
3.转染ZNRD1-AS1及对照，miR-9-5p及对照。
4.采用ZNRD1-AS1及miR-9-5p抑制剂后，CCK8实验检测各组胃癌细胞的敏感性。
5.采用ZNRD1-AS1及miR-9-5p抑制剂后，Transwell实验检测各组胃癌细胞的迁移侵袭能力。
6.采用ZNRD1-AS1及miR-9-5p抑制剂后，westernblot检测各组胃癌细胞中的MMP2、MMP9、Vimentin和E-cadherin的蛋白水平表达情况。
7.Co-IP分析Hsp90/突变型p53的形成变化。
结果：
ZNRD1-AS1与miR-9-5p有两个结合位点，当ZNRD1-AS1上的两个位点都突变时，miR-9-5p无法与ZNRD1-ASP结合；HSP90与miR-9-5p有一个结合位点，当HSP90上的结合位点突变时，miR-9-5p无法与HSP90结合。
抑制ZNRD1-AS1后，与无miR-9-5p抑制BGC823组相比，抑制miR-9-5p组组的胃癌细胞增值率明显升高，迁移侵袭能力增强，差异具有统计学意义（P＜0.05）；侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达均上调，E-cadherin蛋白表达下调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与无miR-9-5p抑制MGC803组相比，抑制miR-9-5p组的胃癌细胞增值率也明显升高，迁移侵袭能力增强，差异具有统计学意义（P＜0.05）；侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达均上调，E-cadherin蛋白表达下调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
siRNA沉默抑制ZNRD1-AS1表达后，miR-9-5p表达水平显著上升，胃癌细胞增殖率、迁移能力及侵袭能力明显下降，胃癌细胞凋亡率上升，细胞侵袭及转移相关蛋白表达水平下降，抑制细胞转移相关蛋白表达水平上升。ZNRD1-AS1可通过与miR-9-5p结合，调控HSP90-p53复合物形成，促进胃癌侵袭转移。
结论：
ZNRD1-AS1可通过与miR-9-5p结合，调节HSP90的功能；ZNRD1-AS1可通过抑制miR-9-5p的功能，调节HSP90-p53复合物形成，促进胃癌细胞侵袭转移相关基因表达，促进胃癌细胞侵袭转移。
背景：
胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，很容易发生侵袭转移，严重影响了患者的预后。尽管手术技术和靶向药物化疗水平不断提高，但由于许多患者在确诊时已伴有腹膜侵袭转移，5年生存率很低。研究表明长链非编码RNA(LongnoncodingRNA,lncRNA)在人类疾病中起关键作用，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等基本功能，近年来受到越来越多的关注。lncRNAZNRD1-AS1（以下简称ZNRD1-AS1）已被证实参与多种癌症的发生和发展，但目前国内外学者对ZNRD1-AS1在胃癌侵袭转移中的作用及其相关的调控机制缺乏系统的研究。本部分实验通过检测不同胃癌患者肿瘤组织中ZNRD1-AS1的表达情况，研究胃癌组织中ZNRD1-AS1的表达和ZNRD1-AS1对胃癌细胞侵袭转移的影响。
方法：
1.组织标本收集：收集2017年至2018年广州医科大学附属肿瘤医院确诊为转移性胃癌的患者胃癌组织标本。通过查阅文献分析，荧光定量PCR检测筛选出4个在胃癌转移中异常表达的lncRNA（PCBP1-AS1，RP6-24A23.7，ZNRD1-AS1，LINC00665），验证这4个lncRNA在胃癌及癌旁中的表达，分析筛选出最合适本项研究的lncRNAZNRD1-AS1，研究其在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞侵袭转移的影响。
2.细胞筛选：检测ZNRD1-AS1在胃癌细胞（3-5株）及人永生化正常胃上皮细胞GES-1中的表达，选择两株高表达的胃癌细胞进行后续的功能实验。
3.筛选ZNRD1-AS1的有效siRNA序列：采用荧光定量PCR方法检测用9组ZNRD1-AS1的siRNA瞬时转染的MGC803细胞，筛选出抑制效率最高的ZNRD1-AS1。
4.CCK8实验检测各组胃癌细胞si-ZNRD1-AS1的敏感性。
5.Transwell实验检测各组胃癌细胞的迁移侵袭能力。
6.westernblot检测各组胃癌细胞中的MMP2、MMP9、Vimentin和E-cadherin的蛋白水平表达情况。
结果：
在4个lncRNA（PCBP1-AS1，RP6-24A23.7，ZNRD1-AS1，LINC00665）中，相对于癌旁组织来说，ZNRD1-AS1在胃癌组织中显著高表达（P＜0.05）。研究发现，与BGC823+siNC组相比，BGC823+siZNRD1-AS1组的胃癌细胞增值率明显下降，迁移侵袭能力减弱，差异具有统计学意义（P＜0.05）；侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达均下调，E-cadherin蛋白表达上调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与MGC803+siNC组相比，MGC803+siZNRD1-AS1组的胃癌细胞增值率也明显下降，迁移侵袭能力减弱，差异具有统计学意义（P＜0.05）；侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达均下调，E-cadherin蛋白表达上调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。实验表明：抑制ZNRD1-AS1可以使胃癌细胞增殖率、迁移能力及侵袭能力明显下降，胃癌细胞凋亡率上升，细胞侵袭及转移相关蛋白表达水平下降，抑制细胞转移相关蛋白表达水平上升。
结论：
ZNRD1-AS1在发生转移的胃癌组织中异常高表达，可以促进胃癌细胞的增殖及侵袭转移。可能是潜在的胃癌侵袭转移肿瘤标志物。
第二部分lncRNAZNRD1-AS1通过miR-9-5p调控HSP90-P53结合促进胃癌侵袭转移
背景：
前面已研究证实ZNRD1-AS1在胃癌组织中表达水平显著升高，可促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。有研究发现MicroRNA-9-5p（miR-9-5p）在许多恶性肿瘤的发生发展进程中发挥作用。热休克蛋白90（HSP90）可通过调控HSP90-P53复合物形成，抑制P53的生物活性，调控胃癌细胞侵袭转移相关基因及多耐药基因的表达，促进胃癌侵袭转移。通过生物信息分析，我们发现ZNRD1-AS1可以与miR-9-5p结合调控HSP90的生物活性。本部分实验将通过生物信息学、荧光素酶实验研究ZNRD1-AS1与miR-9-5p、HSP90之间的关系，探讨其对胃癌细胞侵袭转移影响的机制。
方法：
1.ZNRD1-AS1和miR-9-5p的关系，荧光素酶活性检测ZNRD1-AS1和miR-9-5p结合位点，荧光定量PCR检测干扰ZNRD1-AS1后miR-9-5p的表达。
2.miR-9-5p和Hsp90的关系，荧光素酶活性检测miR-9-5p和Hsp90的结合位点过表达miR-9-5p，荧光定量PCR和westernblot检测Hsp90。
3.转染ZNRD1-AS1及对照，miR-9-5p及对照。
4.采用ZNRD1-AS1及miR-9-5p抑制剂后，CCK8实验检测各组胃癌细胞的敏感性。
5.采用ZNRD1-AS1及miR-9-5p抑制剂后，Transwell实验检测各组胃癌细胞的迁移侵袭能力。
6.采用ZNRD1-AS1及miR-9-5p抑制剂后，westernblot检测各组胃癌细胞中的MMP2、MMP9、Vimentin和E-cadherin的蛋白水平表达情况。
7.Co-IP分析Hsp90/突变型p53的形成变化。
结果：
ZNRD1-AS1与miR-9-5p有两个结合位点，当ZNRD1-AS1上的两个位点都突变时，miR-9-5p无法与ZNRD1-ASP结合；HSP90与miR-9-5p有一个结合位点，当HSP90上的结合位点突变时，miR-9-5p无法与HSP90结合。
抑制ZNRD1-AS1后，与无miR-9-5p抑制BGC823组相比，抑制miR-9-5p组组的胃癌细胞增值率明显升高，迁移侵袭能力增强，差异具有统计学意义（P＜0.05）；侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达均上调，E-cadherin蛋白表达下调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与无miR-9-5p抑制MGC803组相比，抑制miR-9-5p组的胃癌细胞增值率也明显升高，迁移侵袭能力增强，差异具有统计学意义（P＜0.05）；侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达均上调，E-cadherin蛋白表达下调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
siRNA沉默抑制ZNRD1-AS1表达后，miR-9-5p表达水平显著上升，胃癌细胞增殖率、迁移能力及侵袭能力明显下降，胃癌细胞凋亡率上升，细胞侵袭及转移相关蛋白表达水平下降，抑制细胞转移相关蛋白表达水平上升。ZNRD1-AS1可通过与miR-9-5p结合，调控HSP90-p53复合物形成，促进胃癌侵袭转移。
结论：
ZNRD1-AS1可通过与miR-9-5p结合，调节HSP90的功能；ZNRD1-AS1可通过抑制miR-9-5p的功能，调节HSP90-p53复合物形成，促进胃癌细胞侵袭转移相关基因表达，促进胃癌细胞侵袭转移。