构建纳他霉素高产菌株

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纳他霉素(natamycin)也称匹马霉素(pimaricin),是一具有26元环的多烯大环内酯类抗生素,具有专一性抑制真菌生长的生物活性。纳他霉素对人体局部用药高效无毒、无副作用,被广泛应用于食品防腐保鲜、真菌疾病等的治疗等行业。但纳他霉素产量低,生产成本高,使其应用受限,因此利用基因技术提高纳他霉素产量具有重要意义。本文利用分子手段在增加目的基因的拷贝数以增加菌株相应基因的表达量,从而提高纳他霉素的产量。通过通用引物克隆NTF4-24516S rRNA序列并成功与测序。产纳他霉素的生产菌株的16S rRNA比对构建进化树,确定工业菌株NTF4-245是S. natalensis菌株。以S. natalensis纳他霉素生物合成基因簇为模板设计引物扩增基因pimM及含有自身启动子的pimMp片段,并分别与质粒p1168和质粒pSET152连接构建质粒pxq1, pxq2。酶切质粒pxq2获得片段ermE*p-pimM与pSET152质粒连接获得质粒pxq3。与含有adpA、metk、vgb基因的四个质粒pxq4~pxq7通过接合转移转入工业菌株中,通过抗性筛选及抗性PCR验证获得基因工程菌株FNQ1~FNQ7, RT-PCR技术半定量测定基因的表达。通过测量抑菌圈大小初步筛选高产菌株,结合摇瓶发酵确定高产菌株,最终确定纳他霉素高产菌株为FNQ3.3和FNA6.3,分别提高28.79%和28.99%。在YEME中测定的生长曲线证明,增加基因拷贝数的FNQ3.3未对细胞正常生长产生影响,增加了外源基因拷贝数的FNQ6.3可能对细胞生长速度产生影响。
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