目的:在前期研究“配伍对补中益气汤醇提物指纹图谱影响”的基础上,本实验采用HPLC、UPLC-MS/MS法,建立补中益气汤的血清指纹图谱并对血清中移行成分进行鉴别;探究君、臣、佐、使配伍对补中益气汤血清指纹图谱的影响,并对移行成分色谱峰进行归属。采用MTT法、流式细胞仪检测法,进一步研究补中益气汤血清指纹图谱与促进胃粘膜上皮细胞(GES-1)增殖作用的相关性,初步探讨补中益气汤促进胃粘膜上皮细胞增殖的药效物质。方法:1、从血清供试品溶液的制备和色谱条件两方面,以血清指纹图谱中移行成分色谱峰的数量和峰面积为标准进行筛选,建立补中益气汤血清指纹图谱的检测方法。2、分别从给药剂量、给药次数、采血时间三方面,以血清指纹图谱中移行成分色谱峰的数量和峰面积为标准优选制备含药血清的方案。3、建立补中益气汤的血清指纹图谱,通过与空白血清图谱、补中益气汤图谱的比较分析,标定含药血清中的移行成分色谱峰,并进行鉴别。选择君药、臣药、佐药、使药为四个因素,以用药和不用药为两个水平,采用正交设计进行配伍组合,按照补中益气汤标准汤剂的制备方法平行制备成补中益气汤不同配伍水煎液。以全方血清指纹图谱中移行成分色谱峰为对照,依据各个移行成分色谱峰的保留时间和光谱图,标定其他不同配伍的血清指纹图谱中与之对应的移行成分色谱峰,探讨配伍对血清指纹图谱的影响,并对移行成分色谱峰进行归属分析。4、采用MTT法检测补中益气汤含药血清对乙醇诱导损伤的GES-1细胞的作用,计算增殖率,筛选含药血清的浓度和作用时间;将补中益气汤不同配伍的含药血清作用乙醇诱导损伤的GES-1细胞,采用流式细胞仪检测细胞的增殖率,考察君药、臣药、佐药、使药促进细胞增殖的作用。5、谱效相关分析:将补中益气汤及其不同配伍的血清指纹图谱相应的移行成分色谱峰峰面积和细胞增殖率进行相关性分析,采用灰关联度分析、双变量相关分析、偏最小二乘回归分析分别考察谱效的相关性,综合分析三种统计方法数据,评估移行成分色谱峰对促进细胞增殖的作用。结果:1、补中益气标准汤剂的浓度定为1.5g/mL,其他不同配伍水煎液依照补中益气汤的制备方法,最终浓缩成与补中益气汤同体积的水煎液。2、制备含药血清的最佳方案是:以18mL/Kg体质量灌胃,连续灌胃给药两次,间隔60min,末次给药后45min腹主动脉采血。按血清:甲醇=1:3比例沉淀血清中的蛋白,制备血清供试液。3、色谱条件:色谱柱:Hypersil ODS2 C18柱(250mmm×4.6mmm,5μm,大连依利特公司);流动相:0.05%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱;流速:1.OmL/min;柱温:30℃;进样量:20μL;在230nm波长下分析70min。经方法学考察,该色谱方法稳定、可靠,精密度和重复性良好。4、依照补中益气汤HPLC血清指纹图谱的测定方法,建立了空白血清的图谱和10批补中益气汤血清指纹图谱,可观察到10个共有的移行成分,且相应的保留时间RSD和峰面积RSD均符合要求,其中3号峰、5号峰、6号峰及8号峰所代表的成分以原型进入血液,其他成分可能以代谢产物的形式进入血液。采用UPLC-MS/MS法初步推断了 10个移行成分的分子式,其中3号峰是Licorice saponin B2,5号峰是Ferulic acid,8号峰是calycosin-7-0-glucoside,其他结构不明,有待进一步研究。5、依照补中益气汤血清指纹图谱的色谱条件,建立了补中益气汤不同配伍的血清指纹图谱,以补中益气汤血清指纹图谱中10个移行成分色谱峰作为对照,依据各个移行成分色谱峰的保留时间和光谱图,标定了其他不同配伍的血清指纹图谱中与之对应的色谱峰,对移行成分色谱峰进行归属分析。归属分析结果:5号峰、9号峰来源于佐药;3号峰、6号峰、7号峰来源于臣药;8号峰来源于君药;1号峰、2号峰、4号峰、10号峰是由不同配伍产生的。以补中益气汤血清指纹图谱作为对照图谱,其他不同配伍血清指纹图谱与之进行相似度比较,通过夹角余弦法和相似度软件法评价相似度,获得君药、臣药、佐药、使药对10个移行成分色谱峰的贡献大小,即臣药>佐药>君药>使药。夹角余弦法的方差分析结果显示,臣药有极显著性,君药和佐药有显著性,使药无显著性。6、采用MTT法测细胞增殖率,筛选出含药血清作用细胞的最佳浓度为4%,作用时间为24h。采用流式细胞仪检测细胞增殖率,直观分析可知,臣药>君药>佐药>使药,但无显著性差异。7、采用灰关联度分析、双变量相关分析、偏最小二乘回归分析进行谱效相关性研究,综合比较三种方法,结果显示:5号峰、8号峰、10号峰所对应的成分对细胞增殖有促进作用;3号峰、4号峰、6号峰所对应的成分对细胞增殖有抑制作用;1号峰、2号峰、7号峰、9号峰所对应的成分对细胞增殖的作用不显著。结论:1、通过考察给药量、含药血清的制备方案、色谱条件等,建立了补中益气汤的血清指纹图谱,得到10个移行成分色谱峰,且3号峰、5号峰、6号峰及8号峰所代表的成分以原型进入血液,其他成分可能以代谢产物的形式进入血液。2、采用正交设计实验,以指纹图谱相似度为评价指标,考察君、臣、佐、使不同配伍对10个移行成分色谱峰的贡献大小为:臣药>佐药>君药>使药,这与补中益气汤配伍理论中君、臣、佐、使药的配伍地位不完全一致(君药>臣药>佐药>使药)。本实验采用的PDA检测器建立血清指纹图谱,检测到的移行成分色谱峰所代表的成分主要为黄酮类成分,而黄芪中苷类、多糖类成分并未检测到,可能是导致君药、臣药、佐药、使药对血清指纹图谱的贡献与配伍理论不一致的主要原因。建议在今后研究中采用多种不同的检测手段,获得多维多息的血清指纹图谱,更客观、全面反映配伍对血清指纹图谱的贡献。3、采用正交设计实验,以促进细胞增殖作用为评价指标,考察君、臣、佐、使不同配伍对细胞增殖作用的贡献大小为:臣药>君药>佐药>使药,这与补中益气汤配伍理论中君、臣、佐、使药的配伍地位不完全一致(君药>臣药>佐药>使药)。推测可能是补中益气汤的药理作用较多,针对不同的药理作用,君药、臣药、佐药、使药表现出不同的作用效果。因此,在后续的研究中可以适当增加药效指标对此进行考察,以验证此结果。4、采用灰关联度分析、双变量相关分析、偏最小二乘回归分析进行谱效相关性研究,综合比较三种方法的统计结果并结合移行成分色谱峰的归属可知,移行成分色谱峰促进细胞增殖的作用与君臣佐使配伍含药血清对细胞增殖的作用不一致,可能是促进细胞增殖的成分远不止这些,还可能包含一些苷类、多糖类、氨基酸类等成分。