研究背景和目的原发性肝癌是世界范围内第五大常见的恶性肿瘤,死亡率极高,严重威胁了人类的健康。我国的肝癌患者占世界的一半以上,且80%的患者处于中晚期,预后差。肝癌的主要致死原因是侵袭和转移,而在肝癌的远隔转移中,肺转移占主要部分。“种子-土壤”学说认为,肿瘤的转移过程与肿瘤微环境关系密切。因此,进一步深入研究肝癌微环境对肝癌肺转移的影响,对临床靶向肺转移的预防和治疗具有潜在的重要意义。肿瘤微环境是指肿瘤发生发展过程中所处的内环境,包括肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞和多种细胞因子等成分。肿瘤细胞与微环境中非肿瘤细胞之间的交互作用,是肿瘤细胞调控肿瘤微环境的重要过程,对肿瘤细胞的生存和发展有着极其重要的意义。在非肿瘤细胞中,成纤维细胞是主要成分,其活化形式即肿瘤相关成纤维细胞,能够为肿瘤生长提供营养支持和多种活性因子,参与肿瘤的增殖、侵袭转移和耐药等多个方面的调控。在肿瘤微环境中,除了细胞因子发挥作用之外,外泌体作为重要的信息媒介,成为近年来研究的热点。外泌体是细胞生成的一种直径在30到100纳米的囊泡,其内包含有多种核酸、蛋白质和脂质等物质,是介导肿瘤微环境中多种细胞之间生物信息交流的重要介质,在肿瘤的转移、耐药等方面发挥着重要的调控作用。然而,在肝癌肺转移过程中,肝癌细胞如何调控肿瘤微环境以促进肺转移形成,目前尚不清楚。尤其是肝癌细胞与成纤维细胞之间交互作用对肺转移形成的影响,以及肝癌微环境中外泌体对介导肝癌肺转移过程的影响均无系统研究阐明。并且,肝癌细胞在肺转移形成能力上存在较大异质性,这一点是否与肝癌细胞对微环境特别是成纤维细胞的教化能力不同有关,亦缺少相关研究证实。因此,深入研究肝癌细胞对微环境中成纤维细胞的调控及其机制,对理解肝癌肺转移异质性,在临床治疗及预后判断方面具有重要价值。本研究基于肝癌肺转移存在异质性这一现象,系统研究了不同转移能力的肝癌细胞对成纤维细胞的教化能力差异,提出了高转移肝癌细胞与成纤维细胞交互作用的具体机制。本研究将有助于进一步理解肝癌肺转移的具体过程,为临床肝癌肺转移的预防和治疗提供新的思路。研究方法1、选取常见四种肝癌细胞并通过尾静脉注射建立体内肺转移模型,根据肺转移形成能力高低,分为高转移肝癌细胞和低转移肝癌细胞;2、在体外,收集肝癌细胞条件培养基及外泌体,分别刺激人胚肺成纤维细胞,比较转移能力差异对成纤维细胞招募及激活能力差异的影响,以及外泌体在肝癌细胞教化成纤维细胞过程的作用;3、通过尾静脉注射建立肝癌细胞SMMC-7721的肺转移模型,随机分组后分别给予所选四种肝癌细胞的外泌体及对照处理,比较不同转移能力肝癌细胞来源的外泌体对肝癌肺转移的影响;4、通过收集所选四种肝癌细胞的外泌体并进行miRNA芯片测试,分析其表达差异并结合功能实验筛选高转移肝癌细胞教化成纤维细胞过程中的关键miRNA;5、通过miRNA靶点预测并结合功能实验,筛选上述关键miRNA在成纤维细胞中发挥活化作用的直接靶点;6、通过蛋白免疫印迹技术及报告基因实验,进一步研究该miRNA在成纤维细胞中发挥作用的主要信号通路;7、通过建立肿瘤相关成纤维细胞体外诱导模型,研究其对肝癌细胞干性、EMT及肿瘤生长的影响;8、通过分离培养原代肿瘤相关成纤维细胞,研究其对肝癌细胞干性、EMT及肿瘤生长的影响;9、收集临床肝癌组织及血清样本,检测上述miRNA的临床样本中的表达情况及对临床预后的相关性,分析血清外泌体中该miRNA的表达与肝癌肺转移的相关性。结果1、高转移能力的肝癌细胞具有更强的招募及活化成纤维细胞以促进肝癌肺转移的能力;2、高转移肝癌细胞来源的外泌体具有更强的招募及活化成纤维细胞的能力,继而促进肺转移的形成;3、高转移肝癌细胞生成含有miR-1247-3p的外泌体介导了肺转移微环境中的正常成纤维细胞的活化;4、β1,4亚基半乳糖转移酶3是肿瘤细胞教化成纤维细胞过程中miR-1247-3p的直接作用靶点;5、miR-1247-3p通过靶向β1,4亚基半乳糖转移酶3,继而上调β1型整合素-NF-κB信号通路,以激活成纤维细胞;6、活化后的成纤维细胞中IL-6和IL-8分泌能力增强,促进肝癌细胞的干性、EMT和肿瘤生长;7、血清外泌体中mi R-1247-3p的表达与肝癌肺转移呈正相关关系。结论本研究通过不同转移能力肝癌细胞对成纤维细胞的教化实验,发现高转移肝癌细胞具有更强的招募并激活成纤维细胞的能力。具体机制为,高转移肝癌细胞能特异性生成含有大量mi R-1247-3p的外泌体,后者被成纤维细胞摄取后,miR-1247-3p通过靶向β1,4亚基半乳糖转移酶3,进而上调β1型整合素-NF-κB信号通路,从而激活成纤维细胞。活化后的肿瘤相关成纤维细胞中IL-6和IL-8分泌能力增强,促进肝癌细胞的干性、EMT及肿瘤生长。在临床肝癌患者的血清外泌体样本中,miR-1247-3p的表达与肝癌肺转移具有正相关关系。本研究证实了,在肿瘤微环境中,上述高转移肝癌细胞与成纤维细胞的交互作用促进了肝癌肺转移进展,有助于为临床肝癌肺转移的预防和治疗提供新的方向。