生殖细胞的发生是生殖生物学研究的重要内容之一,配子在性腺中的形成更是个体发育中极其重要的时期。与其他生物相比,十足类中关于生殖的分子机制方面的研究相对薄弱,淡水虾类遗传资源的呈现尤其缺乏。因此,大量挖掘、获取淡水虾类生殖相关的基因资源,具有重要的意义和潜在的应用价值。本文基于高通量测序对秀丽白虾的卵巢组织进行了转录组分析,鉴别了 71个与生殖、发育相关的基因;接着以秀丽白虾性腺发育为主线,以获得的Unigene为基础,并在此基础上,克隆了秀丽白虾的3个与生殖细胞的发生、配子的形成相关的基因,并对其序列特征和表达模式进行了分析。实验结果如下:1.秀丽白虾卵巢转录组分析及生殖相关基因的鉴别、分子标记的初步判定为了研究秀丽白虾卵巢发育过程中携带或储存的遗传信息,以卵巢为实验材料,通过文库构建、高通量测序,共获得了 108,789,834条reads,筛选后得到91,921,438条有效reads,利用Trinity拼装得到34,099条contigs,平均长度1198 bp,各个contigs与GenBank上公布的序列搜索比对,获得11965条注释基因的Unigene,采用Blast2GO软件进行GO注释,发现了组织蛋白酶B和L、DEAD-box家族、周期蛋白、周期蛋白依赖性激酶、nanos、piwi、kazal-like serine protease、ribosomal protein L24等71个与生殖、发育相关的基因。通过在线对有注释的contigs进行KEGG分析,得出秀丽白虾卵巢共有1306条基因参与KEGG数据库中的代谢通路。用Mreps软件对contigs进行扫描,获得了 1956个微卫星序列;此外,通过VarScan软件对各contigs进行SNP分析,共获得85590个SNP,包含47150个转换（A/G,C/T）和38440个颠换。这些结果为秀丽白虾甚至整个虾蟹类开展功能基因组研究、种质资源研究提供了有利的基础资料。2.秀丽白虾 vasa基因的分子克隆、特征分析、时空表达及进化分析采用 RT-PCR 和 cDNA 末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术克隆了秀丽白虾vasa基因的cDNA全序列,对其蛋白质结构和功能进行了分析,并研究了其组织表达特征和遗传进化。结果表明:秀丽白虾vasa基因（Em-vasa）cDNA全长 2509 bp,由长 69 bp 的 5’非翻译区（untranslated region,UTR）、631 bp 的 3’非翻译区和1809 bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）组成,编码602个氨基酸。秀丽白虾vasa蛋白含有DEAD-box家族蛋白的9个保守结构域和GG重复序列,在N端具有锌指结构和甘氨酸（G）、精氨酸（R）富集区域。亚细胞定位预测秀丽白虾vasa蛋白定位于细胞质中。秀丽白虾vasa蛋白与日本沼虾、中国明对虾、中华绒螯蟹等vasa蛋白的同源性分别为72%、52%和50%,其在进化过程中以净化选择为主。系统进化分析显示的秀丽白虾基于vasa基因的分子进化地位完全与生物学分类地位相吻合。半定量RT-PCR检测结果显示,Em-vasa仅在秀丽白虾性腺中特异性表达,据此,Em-vasa基因有望成为研究其生殖系起源和分化的分子标记。实时荧光定量PCR技术检测显示,vasa基因转录本在未成熟的卵巢中表达量低于成熟卵巢,在未成熟精巢中表达量显著高于成熟精巢;在胚胎发育中呈现先升高后降低的趋势,并在囊胚期达到最高。3.秀丽白虾成熟促进因子（MPF）组成亚基基因的分子克隆、特征分析及表达模式细胞周期蛋白（cyclin）可以与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）分子结合,形成一种称为MPF的蛋白激酶复合物,主导动物有丝分裂和减数分裂的过程。本实验中,我们通过RT-PCR和RACE方法获得了cyclinA基因的全长cDNA序列和cdc2基因的全长cDNA序列;同时对cyclinA、cdc2在不同组织、不同发育时期的性腺及胚胎中的表达模式进行了研究。获得的秀丽白虾cyclinA基因cDNA序列全长2150 bp,开放阅读框为1356 bp,编码451个氨基酸,5’非编码区为128 bp,3’非编码区为626 bp。通过对此序列进行生物信息学分析,发现预测编码的氨基酸序列高度保守,含有周期蛋白A特有的破坏盒和周期蛋白识别框。多序列比对和同源性分析表明秀丽白虾周期蛋白A和凡纳滨对虾、斑节对虾、拟穴青蟹的同源性分别为73%、72%和63%。对预测蛋白的三维结构分析表明,Em-cyclinA蛋白的中心结构区是由2个相互联系的球形结构组成的,球形结构主要包括α-螺旋和随机卷曲。采用实时荧光定量PCR方法测定cyclinA基因在6种不同组织、未成熟和成熟性腺、不同发育阶段胚胎中的表达情况,结果表明:cyclinA mRNA在卵巢中表达量最高,精巢中表达量相对较高,而在血液、鳃、心脏、肌肉等其它组织中表达量很低;在未成熟卵巢中的表达量显著高于成熟卵巢,在未成熟精巢和成熟精巢中则几乎没有区别;在胚胎发育过程中,原肠期的表达量最高,在无节幼体、溞状幼体和糠虾幼体期降到较低水平。获得的秀丽白虾cdc2基因cDNA全长序列,长1589 bp,开放阅读框为701 bp,编码299个氨基酸,5’非编码区为298 bp,3’非编码区为689 bp。预测的氨基酸序列具有CDC2典型的序列特征,含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点VLHRDLKPQNLLI、细胞周期蛋白家族的基本特征序列EGVPSTAFREISLLKE、蛋白激酶ATP结合区域及三个磷酸化/去磷酸化氨基酸残基。并进行了多序列比对、三维结构预测及进化树分析,多序列比对和同源性分析表明秀丽白虾周期蛋白依赖性激酶和脊尾白虾、日本沼虾、凡纳滨对虾的同源性分别为99.67%、97.66%和93.65%。采用实时荧光定量PCR方法测定cdc2基因在6种不同组织、未成熟和成熟性腺、不同发育阶段胚胎中的表达情况。结果表明:精巢中表达量最高,卵巢中表达量相对较高;血液中表达量相对较低,它几乎不在鳃、心脏和肌肉中表达;在成熟精巢中的表达量约为未成熟精巢的1/2;cdc2 mRNA在未成熟卵巢中的表达略高于成熟卵巢;在胚胎发育过程中,cdc2的表达量先逐渐升高,然后逐渐降低,并在原肠期上调至最高值。Em-cyclinA和Em-CDC2蛋白的氨基酸序列高度保守,从结构上保证了它们在细胞分裂中调节功能的实现,二者在未成熟性腺中的表达量更高提示其在性腺发育中的重要作用;胚胎发育中原肠胚是胚层形成的重要时期,在此阶段Em-cyclinA和Em-cdc2的最高表达量提示着他们在秀丽白虾的胚胎发育中起着重要的作用。