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非梗阻性无精症(NOA)是一种严重影响雄性生育能力的疾病,常常表现为精子发生障碍且引起成熟精子的严重缺失。中国人口协会、国家计生委联名公布的《中国不孕不育现状调研报告》指出,中国育龄夫妇的不孕不育率从20年前的2.5%-3%攀升至近年的12%-15%,其中单纯男性不育的比例达到25%-30%,男女双方共有因素导致的不育比例占20%。而非梗阻性无精症比例约有5%,且目前明确阐述导致非梗阻性无精症精子发生障碍的机制以及可能参与调节精子发生过程重新启动的研究报道还不是很多。一般认为非梗阻性无精症分为三类:完全没有生精细胞的唯支持细胞综合症(Sertoli cell only),有少量生殖细胞的生精能力低下(hypospermatogenesis)以及有精母细胞存在的成熟阻滞(maturation arrest)。针对后两者有生殖细胞的非梗阻性无精症患者,如何调节他们的精子发生使得精子发生重新启动对治疗男性不孕不育具有重要的指导意义。支持细胞和生殖细胞是构成生精小管结构的两种重要细胞。支持细胞的细胞质包裹着不同阶段的生精细胞为这些生精细胞的发育提供重要的营养支持,而支持细胞与生殖细胞之间的相互联系会在精子发生过程中一直发挥功能。成熟的支持细胞之间会形成3种细胞连接:cadherin介导的黏附连接,occludin介导的紧密连接以及connexin介导的间隙连接。这些不同形式的细胞连接构成了支持细胞的重要结构即血睾屏障(BTB),除了 BTB外,不同时期的生精细胞和支持细胞之间的细胞连接确保精子发生过程的顺利进行,这构成了维持精原干细胞功能的物理微环境。另一方面,支持细胞分泌多种细胞因子如GDNF、FGF2、Cxcl12等维持精原干细胞的功能,除此之外,支持细胞为生殖细胞的正常发育提供代谢中间产物,如乳酸等,这些细胞因子和代谢中间产物共同构成了维持精原干细胞功能的化学微环境。物理微环境和化学微环境共同发挥作用保障精子发生过程的正常进行。香叶基香叶基焦磷酸合成酶(GGPPS)是合成胆固醇的甲羟戊酸代谢途径的分支酶,负责由法尼基焦磷酸(FPP)生成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP),这两种焦磷酸是对一些信号分子如Ras蛋白家族进行异戊二烯化修饰的重要底物。我们之前的研究报道指出在睾丸的支持细胞中特异敲除Ggpps后引起雄性不育。此外,我们还发现在非梗阻性无精症患者中Ggpps的表达水平较梗阻性无精症患者中有所下调,这提示我们Ggpps可能参与调节NOA发生的病理机制。我们的实验结果证明NOA患者的精子发生受到阻滞,以至于不能产生有功能的精子,但是具有干性潜能的精原干细胞(SSCs)仍然存在于生精小管的基底室中。在正常生理状态下,完整的BTB结构对SSCs的功能起到不可或缺的作用。此结构不仅为生殖细胞传递其发育所必要的信号分子和营养物质,而且为精子发生过程提供必要的物理结构支持。但是,BTB结构在NOA患者中受到了破坏出现了不完整的结构,除此之外,支持细胞和生殖细胞之间的连接也受到了破坏。当我们在支持细胞中特异性敲除Ggpps后发现敲除小鼠的表型和NOA患者的表型特点有很多相似之处,提示我们这种敲除小鼠可以作为NOA的动物疾病模型。在Ggpps特异敲除的小鼠中,我们发现处于基底室的SSCs仍然具有增殖潜能,但是在管腔中央的精母细胞发生了凋亡,BTB结构以及支持细胞与生殖细胞之间的细胞连接也都受到了破坏。我们接下来的研究证明Ggpps敲除后引起小G蛋白的异戊二烯化修饰的改变以及活性的下降,当我们用法尼基转移酶抑制剂(FTI)处理支持细胞来下调法尼基化修饰后发现敲除鼠中的细胞连接蛋白的表达水平有所上升,证明了Ggpps的特异性缺失通过影响小G蛋白的异戊二烯化修饰影响BTB结构和细胞连接。另一方面,Ggpps的敲除也会下调支持细胞中糖代谢过程中的相关酶的表达,这些基因的表达变化是否引起支持细胞和生殖细胞之间的重要代谢中间产物的交流的变化,从而使得支持细胞不能为生殖细胞的发育提供充足的能量支持而导致精子发生受到阻滞还需进一步的研究。黄连素是一种从传统的药用植物黄连中提取的化合物,可以被用来改善高血糖、高胆固醇等代谢疾病,还能够被用来改善肠道屏障功能障碍。在本研究中我们利用黄连素来修复被破坏的BTB结构和细胞连接以及改善生殖细胞的代谢微环境使得精子发生重新启动,当我们给敲除小鼠用黄连素处理后发现,不管是睾丸重量还是正常形态的生精小管数量都有所回升,结果表明通过改善不完整的BTB结构和细胞连接以及代谢微环境能够让精了发生重新开始。本课题主要从非梗阻性无精症这一临床问题出发,通过建立小鼠模型来阐述参与调节非梗阻性无精症的机制。我们发现Ggpps在支持细胞中的功能在非梗阻性无精症的发生发展中扮演着重要作用,它影响了支持细胞为维持精子发生过程而提供的物理微环境和化学微环境:一方面参与调节血睾屏障和细胞连接,另一方面参与调节支持细胞提供的化学微环境,如代谢的异常。而黄连素从这两方面调节精子发生使得精子发生部分恢复,为NOA患者提供潜在的治疗靶点。