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目的:在糖尿病人群中牙周病的发病率高,病变损害严重且进展迅速,并且牙周病是糖尿病的重要并发症之一。已经证实糖尿病患者血浆中晚期糖基化终产物(advancedglycationendproducts,AGEs)蓄积水平明显增高,牙周组织的损伤修复延缓,提示AGEs在糖尿病牙周病的发生中可能起重要作用。目前,已知脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是引起牙周组织炎症的重要致炎因素之一,在牙周炎发生、发展中的作用越来越受到重视。牙周膜干细胞(periodontalligamentstemcell,PDLSC)是来源于牙周膜的成体干细胞,具有自我复制能力,能产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞,能够维持牙周膜功能的稳定,并且在维持正常的牙周组织更新和牙周炎症组织损伤修复中起到了重要的作用。因此,本研究以体外培养的人牙周膜干细胞为基础,观察AGEs对LPS直接刺激下及LPS刺激单核细胞所得上清液介导下人牙周膜干细胞的增殖能力和多向分化能力的影响。以探讨糖尿病对牙周病形成与发展影响的机制。
方法:采用酶解组织块法培养原代的人牙周膜干细胞(humanperiodontalligamentstemcellsHPDLSCs),并且通过有限稀释法对HPDLSCs进行筛选纯化。然后通过克隆形成率、成骨和成脂多向分化能力、免疫荧光细胞化学、流式细胞技术检测细胞表型分子对HPDLSCs进行初步鉴定。MTT分别检测(正常培养液)C组、(10μg/ml和100μg/mlLPS)LPS组、(50μg/ml、100μg/ml和200μg/mlAGEs)AGEs组、(10μg/mlLPS&100μg/mlAGEs)LA组HPDLSCs的增殖能力。RealTime-PCR分别检测C组、LA组、(10μg/mlLPS)L组、(10ng/mlLPS刺激单核细胞上清液)F组、(10ng/mlLPS刺激单核细胞上清液&100μg/mlAGEs)FA1组、(10ng/mlLPS刺激单核细胞上清液&200μg/mlAGEs)FA2组HPDLSCs成骨基因(ALP、BSP、RUNX-2)和成脂基因(LPL、PPAR-γ)的表达。
结果:1、HPDLSCs的鉴定:1.1HPDLSCs克隆形成率为(32±1.21)％。1.2HPDLSCs在成骨诱导下能形成矿化结节及在成脂诱导下能形成脂滴。1.3免疫荧光细胞化学检测STRO-1间充质干细胞表面相对特异性标志,呈阳性染色。1.4细胞表型鉴定FITC-CD14、CD34阴性率是1.9％、1.7％,CD29、CD105阳性率分别是99.6％、98.6％。PE-CD146阳性率是52.6％,PECY5-CD45阴性率是1.5％。说明实验分离的细胞具有干细胞的特点。
2、MTT显示:2.1与C组比较不同浓度的LPS均抑制HPDLSCs的增殖,差异有统计学意义(p＜0.05)。2.2与C组比较不同浓度的AGEs均抑制HPDLSCs的增殖,且100μg/mlAGEs和200μg/mlAGEs比50μg/mlAGEs抑制作用明显,差异有统计学意义(P＜0.05)。2.3与C组比较L组和LA组HPDLSCs的增殖均受到抑制,且后者比前者抑制作用更明显,差异有统计学意义(P＜0.05)。
3、Realtime-PCR显示:成骨诱导HPDLSCs7天后:(1)与C组比较L组和LA组成骨基因(ALP、BSP和RUNX-2)表达均降低,,但前者比后者降低明显。(2)与C组比较F组成骨基因的表达降低,FA1组成骨基因的表达升高。(3)与C组比较F组和FA2组成骨基因的表达均降低,但后者比前者降低明显。成脂诱导HPDLSCs7天后,与C组比较L组成脂基因(LPL和PPAR-γ)表达降低,而LA组成脂基因表达升高。成骨诱导HPDLSCs14天后,与C组比较L组和LA组成骨基因表达降低,但后者与前者相比明显降低。成脂诱导HPDLSCs14天后,与C组比较L组和LA组成脂基因均升高,但前者比后者升高显著。
结论:1、本实验分离的HPDLSCs具有克隆能力、自我更新能力及多向分化能力等间充质源性干细胞的特点。2、不同的因子及不同浓度的因子刺激HPDLSCs均能影响细胞的增殖,并成浓度依赖性抑制HPDLSCs的增殖。推测糖尿病可能通过AGEs抑制牙周炎存在下细胞的增殖,进而导致牙周组织自我更新能力降低。3、在矿化诱导一周下,无论是LPS直接刺激还是LPS刺激单核细胞上清液刺激HPDLSCs,均导致细胞成骨能力下降,100μg/ml糖尿病相关因子AGEs的加入能改善这种刺激下细胞的成骨能力,使成骨能力有所增加,但200μg/ml糖尿病相关因子AGEs的加入能加强这种刺激对细胞成骨能力的抑制作用,使成骨能力进一步降低。在成脂诱导一周下,LPS直接刺激HPDLSCs,导致细胞成脂能力下降,100μg/ml糖尿病相关因子AGEs的加入能改善LPS对细胞成脂能力的抑制,使成脂能力增加。推测一周内100μg/ml糖尿病相关因子AGEs可能通过促进牙周膜干细胞的成骨成脂分化能力使牙周炎组织自身修复能力增加,然而200μg/ml糖尿病相关因子AGEs可能通过抑制牙周膜干细胞的成骨能力阻止牙周炎组织的自身修复能力。4、在两周内,LPS直接刺激HPDLSCs,导致细胞成骨能力降低,成脂能力增强。100μg/ml糖尿病相关因子AGEs的加入能抑制LPS介导下细胞的成骨成脂能力。推测在两周内100μg/ml糖尿病相关因子AGEs的存在可能通过抑制细胞的成骨能力,阻止牙周组织的修复,导致炎症加重。糖尿病伴牙周炎患者牙周炎炎症加重加深可能是通过影响牙周膜干细胞的生物学特性来影响牙周炎炎症组织的自我更新和自身修复能力。