研究背景膀胱癌是泌尿系统威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一,根据肿瘤浸润的程度,分为表浅性膀胱癌和浸润性膀胱癌。目前临床上对浸润性膀胱癌所采用的最有效的治疗方式是根治性全膀胱切除以及术后放疗、化疗,但是在根治术后2年内约有50%的患者会发生复发,甚至转移,并最终死于肿瘤。这可能的原因是由于50%以上的膀胱癌在肿瘤浸润至肌层时,体内已有微转移灶的存在,而且这些膀胱癌复发、转移的患者对目前临床上所采用的治疗措施的疗效不佳因此,如果能研究出一种能有效地控制甚至清除这些肿瘤的微转移病灶的治疗方法,必将大大提高浸润性膀胱癌的治疗效果。近年来,免疫治疗是很多学者寄望致力于攻克肿瘤的研究热点之一,特别是适用于易复发或转移的肿瘤的治疗,故免疫治疗可能成为浸润性膀胱癌术后防止复发的有效治疗方法。虽然肿瘤的免疫治疗有很好的应用前景,但由于肿癌细胞免疫原性较弱,单纯的灭活肿瘤细胞很难有效地提高机体对肿瘤细胞的免疫识别和杀伤作用。为了增强肿瘤细胞的免疫源性,具有增强免疫学活性的细胞因子(如GM-CSF、IL-2、TNF-α)被广泛地应用于调节机体对肿瘤的免疫识别和诱导机体免疫系统的抗肿瘤免疫反应。随着各种细胞因子应用于肿瘤的免疫治疗的研究的开展,结果证实,应用细胞因子有助于增强机体的抗原呈递能力,提高效应性T细胞的活化和增殖能力,从而增强机体对肿瘤的杀伤活性。然而,单纯游离的细胞因子注入机体后,由于代谢较快,在体内维持的时间很短暂,故取得的治疗效果很有限。为了有效地利用细胞因子的生物学活性,有学者运用基因转染的方法将能编码细胞因子的基因转入至肿瘤细胞,从而可以增强宿主对肿瘤的免疫反应。但由于诸如：基因转染效率较低；表达不稳定；病毒载体安全性等问题的存在,限制了其临床应用。为克服上述存在的不足,我们运用一种新的蛋白质锚定技术：利用细胞表面蛋白质的氨基易与生物素结合以及生物素与链亲和素高效、几乎不可逆地结合的两个特性,将链亲和素(SA)标记的GM-CSF或IL-2快速牢固地锚定于肿癌细胞表面,既保持了细胞因子的生物学活性、延缓其代谢的速度,又包含了整个肿瘤细胞的抗原,从而制备了一种新型肿瘤细胞疫苗,有效地诱导机体抗肿瘤免疫反应。白细胞介素2(IL-2),又称T细胞生长因子,主要由CD4+T和CD8+T细胞产生,具有很重要的免疫调节作用,对静止的T细胞作用不明显,主要促进和维持已活化的T细胞的增殖,增强其杀伤效力。另外,IL-2可促进T细胞所有亚型增殖,包括负性免疫调节性T细胞(Treg)。IL-2的生物学效应是促进免疫反应还是抑制免疫反应取决于体内的抗原递呈或免疫活化情况。在抗原未被有效递呈的情况下,在促进效应性T细胞增殖的同时也促进了Treg的增殖,故一定程度上抑制了体内的免疫反应；而在抗原被有效递呈,特别是在递呈抗原的树突状细胞(DC)成熟的状态下,IL-2可显著增强机体的免疫学效应。粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)由B细胞、T细胞、巨噬细胞等在细胞因子或炎症刺激下产生,可显著地促进造血细胞的增殖、分化,促进其分泌IL-2、TNF、INF等免疫活性的细胞因子。更重要的是,GM-CSF可促进DCs的成熟,进而增强抗原的递呈,从而有效地激活免疫反应。故为了充分发挥两种细胞因子在激活免疫的有效作用,本研究先皮内注射膜修饰GM-CSF的MB49肿瘤细胞疫苗以充分激活DC,促进其增殖和成熟,将肿癌抗原有效地递呈给T细胞,促进其活化,继而应用膜修饰IL-2的MB49肿瘤细胞疫苗以进一步促进效应性T细胞的增殖,而不增加Treg的比例,从而发挥最大的抗肿瘤效应。本研究首先制备SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的MB49膀胱肿瘤细胞疫苗,然后利用小鼠膀胱癌的肺转移模型,证实SA-GM-CSF、SA-IL-2膜锚定膀胱肿瘤细胞疫苗的序贯治疗能够明显抑制肿瘤细胞生长,提高小鼠生存率,产生高强度、持久、特异性的免疫反应,从而为今后治疗和预防膀胱癌的复发和转移奠定基础。本研究分为两部分开展：第一部分：SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的膀胱肿瘤细胞疫苗的制备及其生物学活性检测1、研究目的制备SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的膀胱肿瘤细胞疫苗,并检测SA-GM-CSF、SA-IL-2两种双功能融合蛋白各自锚定肿瘤细胞的效果及其生物学活性2.研究方法(1) SA-GM-CSF或SA-IL-2膜修饰的MB49全肿瘤细胞疫苗的制备及其锚定效果的检测：选取生长良好的MB49膀胱肿瘤细胞,先用30%酒精灭活肿瘤细胞,进而进行生物素化,然后与SA-GM-CSF或SA-IL-2混合孵育反应。经流式细胞仪检测表明,SA-GM-CSF或SA-IL-2融合蛋白能高效地锚定于肿瘤细胞表面。(2)锚定于细胞膜表面的GM-CSF或IL-2的生物活性检测：取上述步骤制备好的SA-GM-CSF或SA-IL-2膜修饰的MB49全肿瘤细胞疫苗,经过液氮及37℃温水中反复冻融3次。然后在4℃、15000rpm/min条件下离心并收集细胞碎片后混于lml PBS中。同时以膜锚定GFP的MB49细胞裂解碎片作为对照组。将上述制备的GM-CSF膜锚定的细胞疫苗裂解碎片悬液按不同稀释浓度加入96孔培养板中,用于培养小鼠骨髓细胞；同样,用IL-2膜锚定的细胞疫苗裂解碎片悬液培养小鼠脾细胞。于37℃C,5%CO2培养箱中培养,72小时后,用MTT法检测两种细胞因子的生物学活性。3、研究结果(1) SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的膀胱肿癌细胞疫苗制备后,通过GM-CSF或IL-2的荧光抗体标记后,用流式细胞仪检测,结果证实：SA-GM-CSF或SA-IL-2能高效地锚定于肿瘤细胞表面,锚定率分别为：98.41%和97.95%。(2)经过MTT法检测,结果表明：锚定于MB49膀胱肿癌细胞膜表面的GM-CSF或IL-2,仍能很好地保持其的生物学活性。4、研究结论我们成功制备了SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的膀胱肿瘤细胞疫苗,细胞因子能高效地锚定于肿瘤细胞表面,且均能很好地保持其生物学活性。第二部分：动物实验：SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的膀胱癌肿瘤细胞疫苗序贯用于治疗转移性膀胱癌的治疗效果及相关机制的研究1、研究目的评价SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的膀胱癌肿瘤细胞疫苗序贯用于治疗转移性膀胱癌的治疗效果,探讨两种细胞因子膜修饰的肿癌细胞疫苗序贯应用时增强肿瘤疫苗的免疫学功能,以及更有效地激活机体产生特异性抗肿瘤免疫的相关机制2.研究方法(1)建立小鼠膀胱癌的肺转移模型以及SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的MB49肿瘤细胞疫苗序贯运用于转移性膀胱癌的治疗作用和预防作用取状态良好的MB49肿瘤细胞,重悬于PBS中,经小鼠尾静脉注入C57B L/6雌性小鼠血循环中,以建立小鼠膀胱癌的肺转移模型。本实验共分五组,每组15只小鼠,其中序贯运用SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的MB49膀胱肿瘤细胞疫苗为实验组,对照组为：GM-CSF膜修饰的MB49肿癌细胞疫苗组、IL-2膜修饰的MB49肿瘤细胞疫苗组、单纯灭活的MB49肿瘤细胞组、PBS组。建立小鼠膀胱癌的肺转移模型后,实验组于肿瘤细胞攻击的当天、第4天、第8天分别于右后腿皮内注射100ul浓度为1×107/ml的GM-CSF莫修饰的MB49膀胱肿瘤细胞疫苗,随后于肿癌细胞攻击的第12天、第16天、第20天分别于右后腿皮内注射100μ1浓度为1×107/ml的IL-2膜修饰的MB49膀胱肿癌细胞疫苗。对照组按同样的时间点分别行六次皮内注射GM-CSF膜修饰的MB49肿癌细胞疫苗、IL-2膜修饰的MB49膀胱肿瘤细胞疫苗、单纯灭活的MB49肿瘤细胞、PBS。疫苗治疗后,每天观察小鼠的生存状态,并记录小鼠的生存时间。预防性实验中,先按上述方法皮内注射疫苗,随后于六次疫苗接种结束后第7天,经小鼠尾静脉以1×106/100ul的状态良好的MB49肿瘤细胞注入C57B L雌性小鼠血液循环中,每天观察小鼠的生存状态,并记录小鼠的生存时间。(2)特异性毒性T淋巴细胞反应(CTL)在肿瘤疫苗治疗结束后第7天,随机取小鼠脾脏,并研磨而制成单细胞悬液。以生长状态良好的MB49膀胱肿瘤细胞作为靶细胞,将浓度调整至1×101/ml。按100：1、50：1、25：1、12.5：1的效靶比加入至96孔培养板中,每种浓度设3个复孔。置于37℃下培养4小时后,收集各孔上清,按CTL试剂盒说明操作检测LDH活性,以评价效应性T细胞对MB49肿瘤细胞的毒性作用。(3)记忆性免疫实验：肿癌细胞疫苗开始治疗后的第60天,经小鼠尾静脉以1×10"/100ul的状态良好的MB49肿瘤细胞再次攻击实验组存活的C57BL雌性小鼠,以同期平行空白对照的小鼠作对照。观察两组小鼠生存状态,并记录小鼠的生存时间。(4)特异性免疫实验(体外和体内)：1)体外：在肿瘤疫苗治疗结束后第7天,取小鼠脾脏,并研磨而制成单细胞悬液。以MB49膀胱癌细胞和RM-1前列腺癌细胞作为靶细胞,按效靶比100：1、50：1、25：1、12.5：1加入96孔培养板中培养4小时后,收集各孔上清,按CTL试剂盒说明操作检测LDH活性,以评价其对MB49肿瘤细胞和RM-1前列腺癌细胞的杀伤能力。2)体内：在肿瘤细胞疫苗开始治疗后的第60天,取实验组中存活的小鼠,于左右两侧后腿分别皮下注射100ul(浓度均为1×107/ml) RM-1前列腺癌细胞和MB49膀胱癌细胞,随后每天监测两侧肿瘤大小的变化。(5) SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的MB49肿瘤细胞疫苗序贯治疗的相关免疫学机制研究1)脾脏中DC细胞的检测：在SA-GM-CSF膜修饰的MB49肿瘤细胞疫苗治疗的第12天,取小鼠脾脏,研磨成细胞悬液,加入PE-antiCDllc和FITC-antiCD80混匀后避光孵育反应,用流式细胞仪检测成熟型CDllc+CD80+DC细胞的含量。2)外周血中CD4+T、CD8+T、CD8+IFN-γ+T、CD4+FOXP3+T (Treg)淋巴细胞的检测：分别于肿瘤疫苗开始治疗的第12天和治疗结束后第7天,取小鼠全血,加入PE-antiCD4和FITC-antiCD8混匀后避光孵育反应,流式细胞仪检测CD4+T和CD8+T淋巴细胞的含量；在肿瘤疫苗治疗结束后第7天,取小鼠全血,加入30%酒精灭活的MB49细胞作为刺激细胞,于5%C02及37℃培养箱中培养24小时,于培养结束前4-6小时加入终浓度为3uM monensin共同培养以阻止细胞因子向外转运,用流式细胞仪检测CD8+IFN-γ+T细胞；在肿瘤疫苗治疗结束后第7天,取小鼠全血,加入FITC-anti-CD4抗体避光孵育,加入固定液重悬细胞于室温下避光固定,用穿透缓冲液重悬并洗涤2次后,加入PE-anti-FOXP3单抗,4℃避光孵育,用流式检测Treg细胞。3)免疫组化分析各组肿瘤组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞的数量：在肿瘤疫苗治疗结束后第7天,取小鼠肺组织,制作冰冻切片。然后经丙酮固定、3%过氧化氢孵育、三羊血清封闭、一抗(anti-mCD4或anti-mCD8)、二抗孵育、辣根过氧化物酶孵育、DAB显色和苏木精复染等步骤进行免疫组化染色,在高倍显微镜下观察肿瘤组织中浸润性CD4+T、CD8+T淋巴细胞的数量。4)小鼠IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12的EILSA检测：在肿瘤疫苗治疗结束后第7天,取小鼠全血,高速离心后取血清,按EILSA试剂盒操作说明进行,检测经疫苗治疗后的小鼠外周血中IFN-T、IL-4、IL-10和IL-12的水平。3、研究结果(1)预防性实验：与对照组相比较,SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的MB49膀胱肿瘤细胞疫苗组小鼠的生存期最长(χ2=46.399,P=0.000)。提示：SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的MB49膀胱肿瘤细胞疫苗序贯应用更能增强肿瘤细胞疫苗的免疫原性。(2)治疗性实验：经SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的MB49膀胱肿瘤细胞疫苗序贯治疗后,小鼠的生产时间最长,具有显著性差异(χ2=53.306, P=0.000); GM-CSF修饰的肿瘤细胞疫苗治疗有助于促进脾脏中DC的成熟(F=193.075,P=0.000)；外周血和肿瘤组织中的CD4+T和CD8+T淋巴细胞增多,具有显著性差异((CD4+T淋巴细胞)：F=250.305, P<0.01;(CD8+T淋巴细胞)：F=72.120,P<0.01),外周血中分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞也增多,具有显著性差异(F=159.776,P<0.01),但是CD4+Foxp3-Treg细胞并不增多；血清中产生更多的IFN-γ和IL-12,而IL-4和IL-10并不增加。(3)记忆性免疫实验：对治疗结束后存活的小鼠进行MB49肿瘤细胞再次攻击,结果表明,实验组小鼠的生存期延长,具有显著性差异(F=12.094,P=-0.001),提示：经SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的MB49膀胱肿瘤细胞疫苗序贯治疗可以诱导机体产生记忆性免疫反应,有效地保护小鼠抵抗肿瘤的再次攻击。(4)特异性免疫实验：体内和体外特异性免疫实验结果表明,SA-GM-CSF、 SA-IL-2膜修饰的MB49膀胱肿瘤细胞疫苗序贯组能诱导机体产生较强的杀伤MB49肿癌细胞的淋巴细胞毒性,而对RM-1前列腺癌肿瘤细胞的作用较小。4、研究结论动物实验结果表明,SA-GM-CSF、SA-IL-2膜修饰的MB49膀胱肿癌细胞疫苗序贯治疗,可以有效地促进DCs的成熟,有助于肿癌细胞抗原的识别,诱导体内产生大量的效应T淋巴细胞,产生大量激活免疫反应的细胞因子,如IFN-γ和IL-12,从而增强机体杀伤MB49膀胱肿瘤细胞的能力,产生针对MB49膀胱肿瘤细胞的记忆性、特异性免疫作用,有效地抑制膀胱转移癌的发生和发展。这些研究结果将为今后开展膀胱转移癌的免疫治疗奠定基础。