禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi（L.）属于半翅目Hemiptera蚜科Aphididae,在我国各麦类作物种植区均有分布,也是全球重要的麦类作物害虫之一。禾谷缢管蚜具有全周期型（营周期性孤雌生殖,Cyclical parthenogenesis,CP）和不全周期型（营专性孤雌生殖,Obligate parthenogenesis,OP）等不同生活史类型。全周期型禾谷缢管蚜的生活史由多个孤雌生殖世代和一个有性生殖世代共同组成,而不全周期型禾谷缢管蚜全年进行孤雌生殖。全周期型禾谷缢管蚜存在寄主转换现象,在初夏时分,有翅孤雌蚜从原生寄主（李属植物）迁飞到次生寄主（禾本科作物）上进行危害,在次生寄主上进行孤雌生殖;当秋季来临时,全周期型禾谷缢管蚜能够感受温度和光周期等环境因子的变化,进而产生有性蚜;不全周期型禾谷缢管蚜常年在次生寄主上危害,即使在低温短日照的诱导条件下,也不可能产生有性世代。两种生殖方式的禾谷缢管蚜对光周期现象的响应存在差异,而目前有关蚜虫响应光周期现象的内在机制还未见报道。本论文研究了生物钟基因在不同生殖方式禾谷缢管蚜光周期响应中的作用,研究结果对于明确禾谷缢管蚜光周期现象的内在机制、分析环境条件对禾谷缢管蚜种群动态的影响、探究蚜虫生殖转换的分子机理等具有重要意义。主要结果如下:一、不同生殖方式禾谷缢管蚜对低温短日照的差异响应在不全周期型的禾谷缢管蚜种群中,低温和短日照长期诱导处理后对子代蚜虫成虫寿命,总寿命和繁殖力有负面的影响。处理组（低温和短日照长期诱导处理）的净增殖率也显著低于对照组（长期饲养在常温和长日照蚜虫）。在全周期型的禾谷缢管蚜种群中,处理组若虫的发育历期均显著长于对照组,其成虫寿命和总寿命显著缩短,平均世代时间显著延长,平均繁殖力显著降低,生命表参数λ、r_m、R₀和GRR均显著低于对照组。这些说明不同生殖方式的禾谷缢管蚜对长期低温短日照处理的响应存在差异,并且,诱导条件对不全周期型的蚜虫同样也有影响。全周期型禾谷缢管蚜在诱导条件下产生的产雌性母的成虫寿命和总寿命均显著短于孤雌蚜的成虫寿命和总寿命,并且产雌性母有更长的繁殖前期和更低的内禀增长率、周限增长率、繁殖力、净增殖率和总生殖率。因此,产雌性母的繁殖潜力、适应性和种群扩张能力均显著低于孤雌蚜。传统的观点认为,雄蚜和雌性蚜在原生寄主（李属植物）进行交配产生越冬卵。本研究发现,饲养在次生寄主（小麦）上的产雌性母能产生雌性蚜,雌性蚜与雄蚜均能在次生寄主上长期存活,并且饲养在次生寄主上的雌性蚜也能与雄蚜进行交配产生越冬卵。正常条件下雄蚜和雌性蚜的寿命显著短于在诱导条件下的寿命,且在诱导条件下能产生少量的越冬卵,这些都说明有性世代也能在次生寄主上存活和繁殖,同时外界环境条件对有性世代的存活和繁殖有很大的影响。二、禾谷缢管蚜生物钟基因的克隆及序列分析本研究表明,禾谷缢管蚜有Cry1和Cry2两个Cry基因,同时存在timeless（Tim1）和timeout（Tim2）基因。本研究还从禾谷缢管蚜中成功克隆到6个其它生物钟基因（Per、Clk、Cyc、Shy、Pdp 1和Vri）。系统发育分析结果表明,这10个基因的氨基酸序列分别与豌豆蚜、桃蚜和俄罗斯麦蚜各对应基因氨基酸的序列同源性较高,进化关系较近。不同生物钟基因在不同物种中的序列保守性不同,其中,Shy基因序列高度保守,而Per和Tim1基因的序列在不同物种中差异很大,其与同为半翅目的其他昆虫的相应基因序列间的相似度都在35%以下。三、温度和光周期对禾谷缢管蚜生物钟基因的影响除Cyc基因在昼夜条件下表达较为稳定外,禾谷缢管蚜其它生物钟基因在昼夜不同时间点的表达量存在显著差异。温度能够影响部分生物钟基因的表达。Cry2、Clk、Cyc、Per和Vri基因在常温条件下的表达量显著高于低温条件的表达;Cry1和Tim1基因在低温条件下的表达量显著高于常温条件;Tim2、Pdp1和Shy基因在常温与低温条件下的表达量没有显著差异。光周期对生物钟基因的昼夜表达也有影响,仅Cry1基因在长日照条件下的表达显著高于短日照条件。全暗条件下,不管温度如何,10个生物钟基因在6个不同时间点的表达量均有显著差异。温度能够显著影响生物钟基因的表达,其中Cry2、Clk、Cyc、Tim1、Tim2、Shy和Pdp1基因在24℃下的表达量显著高于其在4℃下的表达水平,Clk、Cyc、Per、Tim2、Shy和Pdp1基因在12℃下的表达量显著高于其在4℃下的表达水平。仅Cry1和Vri基因在4℃仍保持较高的水平。全暗条件下,生物钟在头部和胚胎中的表达存在一定差异,不同温度下,在这两个组织间表达存在差异的生物钟基因不同。24℃条件下,Cry2、Per、Tim1、Tim2、Pdp1和Shy基因在头部的表达量显著高于在胚胎中的表达量;12℃条件下,Clk、Per、Tim1和Shy基因在头部的表达量显著高于在胚胎中的表达量。在这两个温度下没有生物钟基因在胚胎中表达量显著高于头部。四、不同生殖方式禾谷缢管蚜生物钟节律基因在昼夜条件下的表达母代的饲养条件会显著地影响子代对光周期和温度的响应,饲养在长日照常温条件下的CP-LN种群诱导后第二代才有少量的雄蚜产生,第三代产雌性母、雌性蚜和雄蚜才大量产生。而长期饲养在长日照低温的CP-LL种群诱导后第一代就有产雌性母和少量的雄蚜产生,诱导后第二代产雌性母、雌性蚜、雄蚜均有产生。这些结果表明,母代饲养于低温条件时会导致雄蚜和雌性蚜虫在诱导条件下提早产生。除饲养在长日照常温的OP-LN种群G₁代禾谷缢管蚜的Per基因在昼夜不同时间点的表达不存在显著差异外,其他种群的生物钟基因在昼夜不同时间点的表达存在显著差异。诱导条件下,部分生物钟基因在不同生殖方式禾谷缢管蚜种群中的表达存在差异,且随低温短日照诱导时间的变化,各生物钟基因的表达也存在变化。长日照低温条件下,除Clk基因以外,其他9个生物钟基因在CP-LL与OP-LL种群禾谷缢管蚜间的表达量均差异显著。其中,Cry1、Tim1、和Shy基因在CP-LL种群中的表达量显著低于OP-LL种群,而Cry2、Cyc、Tim2、Vri和Pdp1基因在CP-LL种群中的表达量显著高于OP-LL种群。诱导条件下,除Shy基因以外,其它九个生物钟基因在CP-LL和OP-LL种群G₁代蚜虫间的表达量均存在显著地差异。其中,Cry1、Clk、Tim1、Tim2和Pdp1基因在CP-LL种群中的表达量显著高于OP-LL种群,而Per和Vri基因在CP-LL种群中的表达量显著低于OP-LL种群。五、六个核心生物钟基因在禾谷缢管蚜光周期现象中的作用本研究发现,干扰某一个生物钟基因会显著影响其他生物钟基因的表达,其中,Cry1基因的干扰使Cry2、Tim1、Clk、Cyc、Shy和Vri基因的表达水平显著降低;干扰Cry2基因使Cry1基因的表达水平显著升高,使Tim1、Clk和Per基因的表达水平降低;干扰Clk基因使Cry2、Tim1和Cyc基因的表达水平显著降低,使Per基因的表达水平显著升高;干扰Cyc基因使Clk和Vri基因的表达水平显著降低,使Cry1、Pdp1和Per基因的表达水平升高;干扰Per基因使Cry2基因的表达水平显著降低,使Tim1基因的表达水平降低和Cyc基因的表达水平升高;干扰Tim1基因使Shy和Per基因的表达水平显著降低,使Clk和和Cyc基因的表达水平显著升高。干扰6个核心生物钟基因（Cry1、Cry2、Tim1、Clk、Cyc和Per）并不会使不全周期型禾谷缢管蚜产生有性世代,而干扰这6个核心生物钟基因会影响全周期型禾谷缢管蚜子代产雌性母、雄蚜、雌性蚜、有翅孤雌蚜和无翅孤雌蚜的数量。干扰Cry1、Clk和Cyc会使无翅孤雌蚜的数量显著下降,也使子代雌性蚜和雄蚜的数量增多。干扰Cry2、Per和Tim1会使子代无翅孤雌蚜的数量显著升高,子代雌性蚜和雄蚜的数量显著降低。光周期能够显著影响禾谷缢管蚜的生长和发育,在常温条件下,禾谷缢管蚜在短日照条件下的二龄、三龄和四龄若虫发育历期和繁殖前期均显著长于长日照条件。温度也能显著影响禾谷缢管蚜的生长和发育。常温条件下的禾谷缢管蚜一龄、二龄、三龄和四龄若虫发育历期和繁殖前期均显著短于低温条件下的发育历期和繁殖前期。诱导前种群相同时,不管是饲养在长日照常温还是长日照低温,诱导后饲养在长日照低温条件下种群的产生雄蚜、雌性蚜和只产生有性世代所需的诱导光周期循环次数少于诱导完后饲养在长日照常温条件下种群所需的循环次数。这说明诱导后的饲养条件对雄蚜和雌性蚜的产生有重要的影响,即诱导后饲养条件为低温时可能有利于雄蚜和雌性蚜的产生。并且,母代处于低温条件时也会促进子代雄蚜和雌性蚜尽早产生。CP-LN种群诱导后转移至长日照低温条件后能产生相对较多的雄蚜和雌性蚜,CP-LL种群诱导后转移至长日照低温条件后能产生相对较多的雌性蚜。CP-LN种群在低温短日照条件诱导11和10天后,在两个对照组中均未有雄蚜产生,而在注射dsCry1、ds Clk和dsCyc的三个处理组中都有极少量的雄蚜产生。CP-LN种群诱导15和14天后,两个对照组中也均未有雌性蚜产生,而在注射dsCry1、dsClk和dsCyc的三个处理组中都有极少量的雌性蚜产生。CP-LN种群诱导24和23天后,两个对照组中均有无翅孤雌蚜和有翅孤雌蚜产生,而在注射dsCry1、dsClk和dsCyc的三个处理组中均没有发现无翅孤雌蚜和有翅孤雌蚜产生。CP-LN种群诱导12天后,两个对照组中均有雄蚜产生,而在注射dsCry2、dsTim和dsPer的三个处理组中都没有雄蚜产生。CP-LN种群诱导16天后,两个对照组中均有雌性蚜产生,而在注射dsCry2、dsTim和dsPer的三个处理组中均没有发现雌性蚜。CP-LN种群诱导25和26天后,两个对照组中均没有无翅孤雌蚜和有翅孤雌蚜产生,而在注射dsCry2、dsTim和ds Per的三个处理组中均发现无翅孤雌蚜和有翅孤雌蚜的存在。不同生物钟基因对蚜虫光周期计时（photoperiodic timer）过程的影响存在差异。CP-LN种群诱导13天后,两个对照组中均有雄蚜产生,在注射dsCry2和dsPer的处理组中都没有雄蚜产生,而在注射dsTim的处理组中有少量雄蚜产生。CP-LN种群诱导17天后,两个对照组中均有雌性蚜产生,在注射dsPer的处理组中没有雌性蚜产生,而在注射dsCry2和dsTim的处理组中都有少量雌性蚜产生。六、褪黑素在禾谷缢管蚜光周期现象中的作用本研究从禾谷缢管蚜中成功克隆了3个AANAT基因（AANAT1、AANAT2和AANAT3）和1个TPH基因。饲养在不同光温条件下的禾谷缢管蚜种群的褪黑素合成相关基因在不同时间点的表达程度存在显著差异。光周期和温度能够影响这四个基因的表达,这些基因在不同光温条件下达到峰值表达水平的时间也存在很大的差异。禾谷缢管蚜AANAT1、AANAT2和AANAT3基因在全天黑暗条件下的表达显著高于全天光照条件。全暗条件经光照处理会显著降低AANAT1、AANAT2和TPH基因的表达。全天光照条件经黑暗处理后AANAT1、AANAT2和TPH基因的表达显著增加。饲养在黑暗条件下不同温度的禾谷缢管蚜种群的褪黑素合成相关基因在不同时间点的表达水平也不同。不管饲养温度为常温（24±1℃）还是低温（12±1℃）,AANAT3基因在头部的表达水平均显著高于胚胎。生物钟基因与褪黑素之间存在相互作用,干扰Cry1基因导致褪黑素合成相关基因AANAT1、AANAT2、AANAT3和TPH的表达水平显著升高。Clk和Cyc基因的干扰使AANAT1和AANAT3基因的表达显著下降。而Tim和Per基因的干扰使AANAT3基因的表达显著下降。注射外源褪黑素能够导致Cry1、Clk和Cyc基因的表达水平显著降低;也能影响Cry2、Per和Tim1的表达。全周期型和不全周期型种群AANAT1、AANAT2、AANAT3和TPH基因在诱导条件下不同世代间的表达存在显著地差异。饲养在长日照常温条件下的禾谷缢管蚜在短日照低温条件诱导二代后,AANAT2基因在全周期型蚜虫中的表达水平显著低于不全周期型禾谷缢管蚜。不管饲养在长日照常温条件下的禾谷缢管蚜在短日照低温条件诱导一代还是三代,饲养在长日照低温条件下的禾谷缢管蚜还是饲养在该条件下的禾谷缢管蚜经短日照低温条件诱导一代,AANAT3基因在全周期型蚜虫中的表达水平均显著高于不全周期型禾谷缢管蚜。AANAT1、AANAT2、AANAT3和TPH基因在五个不同蚜型中的表达情况存在差异。三个AANAT基因在雄蚜中的表达量最高,其次是产雌性母、有翅孤雌蚜和无翅孤雌蚜。这三个基因均在雌性蚜中的表达量最低。TPH基因在产雌性母中的表达最高,其在雌性蚜中的表达水平也最低。注射一次褪黑素或者干扰AANAT3基因并不会使饲养在长日照常温条件下的全周期型禾谷缢管蚜产生有性世代,也不会使不全周期型禾谷缢管蚜产生有性世代。褪黑素也能够显著降低禾谷缢管蚜的繁殖力。诱导一段时间的全周期型禾谷缢管蚜注射褪黑素后产生的蚜型种类没有变化,但雄蚜比例显著增加,无翅孤雌蚜比例显著降低。诱导一段时间的全周期型禾谷缢管蚜干扰AANAT3基因后产生的蚜型种类也没有变化,但无翅孤雌蚜和有翅孤雌蚜的比例显著增加,产雌性母和雌性蚜的比例显著降低。褪黑素在蚜虫光周期钟计时（photoperiodic timer）过程中存在重要的作用。