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背景与目的:沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）是一种严格细胞内寄生的革兰阴性病原体,主要以隐匿的持续性感染人泌尿生殖道而诱发尿道炎、子宫内膜炎和输卵管炎,可进一步导致异位妊娠和输卵管性不孕等严重并发症。迄今为止,Ct持续性感染作用机制尚未完全阐明,且无有效疫苗来预防,因此,对其复杂分子调控机制进行全面深入研究是有效预防Ct持续性感染并阻断其严重并发症发生发展的关键。长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,研究证实lncRNA可通过多种机制调控免疫反应和宿主细胞生物学行为,促进胞内病原体的增殖和感染。本研究在课题组前期已构建Ct持续性感染lncRNA差异表达数据库的基础上,拟进一步筛选出关键lncRNAs,并分析lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,通过构建持续性感染细胞模型以及小鼠生殖道感染模型,探究关键lncRNAs及其靶点调控Ct持续性感染抗宿主细胞凋亡、衣原体胞内生存以及生殖道炎症应答具体机制。本研究的开展将深入揭示持续性感染介导宿主细胞命运,炎症应答等具体分子机制,为后续进一步寻找和开发新的Ct防治药物提供重要科学依据。方法:1.层次聚类分析Ct持续性感染12 h、24 h、40 h后lncRNAs和mRNAs差异表达数据情况;GO和KEGG分析持续性感染差异表达mRNAs的功能和信号通路富集情况。2.从持续性感染lncRNAs和mRNAs芯片数据中随机选取10个上调的lncRNAs（LINC01128、MIAT、CYTOR、ZEB1-AS1、FRMD6-AS2、NNT-AS1、LINC00240、EBLN3P、PANDAR、IRF1）,5个下调的lncRNAs（LINC00466、SEMA3B-AS1、KRT7-AS、HCG18、LINC00163）和3个上调的mRNAs（NEDD4L、MAP4K4、ZEB1）进行q RT-PCR验证。3.综合运用Lncbase、ENCORI、miRDB以及Clue Go等生物信息学软件筛选关键lncRNAs和mRNAs,Cytoscape构建lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,分析调控网络富集功能和信号通路。4.q RT-PCR检测lncRNA MIAT、ZEB1-AS1、IRF1特异性si RNA的干扰效果;FCM和Hoechst染色分别检测干扰MIAT、ZEB1-AS1、IRF1前后持续性感染细胞的凋亡率;JC-1荧光探针分别检测干扰MIAT、ZEB1-AS1、IRF1前后持续性感染细胞的线粒体膜电位情况;Western blot分别检测干扰MIAT、ZEB1-AS1、IRF1前后凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved caspase 3的表达情况;IFA分别检测干扰MIAT、ZEB1-AS1、IRF1前后细胞色素C释放情况以及Ct感染率。5.采用Lnc ATLAS分析和RNA荧光原位杂交鉴定ZEB1-AS1亚细胞定位;RNAfold预测ZEB1-AS1最小自由能二级结构;ENCORI预测和双荧光素酶报告基因验证ZEB1-AS1与miR-1224-5p、miR-1224-5p与MAP4K4的结合位点。6.分别在He La细胞中转染siZEB1-AS1、siMAP4K4、miR-1224-5p mimic、miR-1224-5p inhibitor 24 h后进行Ct持续性感染处理,q RT-PCR检测转染前后ZEB1-AS1、miR-1224-5p、MAP4K4的表达情况;FCM和Hoechst染色检测细胞凋亡率;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位情况;IFA检测细胞色素C释放情况;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved caspase 3的表达,并进一步检测MAPK信号通路活化情况。7.构建MAP4K4慢病毒干扰表达载体LV10N-si MAP4K4和对照载体LV10N-si NC,随后侵染RAW 264.7细胞48 h后,IFA检测m Cherry红色荧光的表达,q RT-PCR检测MAP4K4转录水平,验证慢病毒转染沉默效果。8.IFA检测si MAP4K4和ERK抑制剂对Ct和鼠衣原体（Chlamydia muridarum,Cm）感染率的影响;使用Mouse Cytokine Array G2检测si MAP4K4和ERK抑制剂对Cm感染RAW 264.7中32种细胞因子表达的影响;生物信息学分析差异表达细胞因子富集的功能和信号通路。9.构建鼠衣原体（Cm）生殖道感染BALB/c小鼠模型,分别用LV10N-si NC、LV10N-si MAP4K4、DMSO和ERK抑制剂对感染后小鼠进行干预并分组为SPG、Cm、Cm+LV10N-si NC、Cm+LV10N-si MAP4K4、Cm+DMSO和Cm+PD98059;IFA、q RT-PCR和IHC验证LV10N-si NC、LV10N-si MAP4K4干预效果;感染后第3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天,用阴道拭子取小鼠生殖道分泌物,IFA检测每组小鼠生殖道衣原体清除情况;ELISA检测小鼠血清、生殖道分泌物中炎症细胞因子;CCK-8检测脾细胞增殖;流式细胞术检测脾细胞CD4+、CD8+等细胞亚群、细胞因子水平。10.Cm感染后第15天,HE染色检测小鼠生殖道组织急性炎症病理情况;IHC检测生殖道切片炎症相关分子表达（MPO、IBA-1等）;Cm感染后第60天,分离小鼠生殖系统、肝脏、脾脏和肾脏,肉眼对小鼠输卵管积水程度进行观察及评分;HE染色评估小鼠输卵管、子宫角、肝脏、脾脏、肾脏病理损伤情况;IHC检测输卵管部位MAP4K4的差异表达,以及相关炎症细胞分子MPO、IBA1的表达情况。结果:1.层次聚类分析发现持续性感染24 h有大量表达模式相似的lncRNAs和mRNAs聚集成类;GO分析发现差异表达mRNAs富集于细胞命运、先天性免疫应答和细胞因子应答等功能;KEGG分析发现差异表达mRNAs富集于NOD-like受体信号通路、NF-κB信号通路和肿瘤坏死因子等信号通路。2.q RT-PCR结果显示,持续性感染诱导lncRNA MIAT、LINC01128、CYTOR、ZEB1-AS1、FRMD6-AS2、NNT-AS1、LINC00240、EBLN3P、PANDAR和IRF1表达上调,LINC00466、SEMA3B-AS1、KRT7-AS、HCG18和LINC00163表达下调;持续性感染诱导mRNA NEDD4L、MAP4K4和ZEB1表达上调,结果与lncRNAs和mRNAs芯片表达谱数据中的趋势基本一致。3.生物信息学分析筛选出关键lncRNA MIAT、ZEB1-AS1、IRF1,构建了三者lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,Clue Go发现调控网络富集于线粒体去极化反应、剪接体tri-sn RNP复合体组装以及翻译后蛋白质靶向膜转位等功能。4.q RT-PCR结果显示,与si NC组相比,si MIAT、si ZEB1-AS1和si IRF1组相应lncRNA转录水平显著下调（P＜0.01）;Hoechst染色结果显示,Ct-si MIAT组、Ct-si ZEB1-AS1组和Ct-si IRF1组的细胞凋亡率分别为17.29%（P＜0.01）、13.27%（P＜0.05）和15.08%（P＜0.05）,高于Ct-si NC对照组（9.21%）;流式细胞术结果与Hoechst染色结果基本一致;JC-1结果显示,Ct-si MIAT和Ct-si ZEB1-AS1组的MMP显著低于Ct-si NC组（P＜0.01）;Western blot结果显示,与Ct-si NC组相比,Ct-si MIAT和Ct-si ZEB1-AS1组Bcl-2/Bax比值下调,cleaved caspase 3表达升高（P＜0.05）;IFA结果显示,与Ct-si NC组相比,Ct-si MIAT和Ct-si ZEB1-AS1组细胞色素C释放明显增加;Ct-si MIAT组子代IFUs为（5.18±0.25）×106显著高于Ct-si NC组[（3.26±0.35）×106]（P＜0.01）,Ct-si MIAT组包涵体平均直径是Ct-si NC组的1.5倍（P＜0.01）。5.Lnc ATLAS预测53.2%的ZEB1-AS1定位于He La细胞中的细胞质,RNA-FISH结果显示,ZEB1-AS1主要分布于细胞质中;RNAfold预测ZEB1-AS1最稳定结构包含茎区、内环和发卡环区域;ENCORI预测以及双荧光素酶报告基因结果显示,miR-1224-5p与ZEB1-AS1、miR-1224-5p与MAP4K4具有相互作用结合位点。6.q RT-PCR以及Western blot结果显示,ZEB1-AS1可通过吸附miR-1224-5p的ce RNA机制间接调控MAP4K4的表达;Hoechst结果显示,miR-1224-5p过表达提高了He La细胞的凋亡率,而Ct持续性感染降低了miR-1224-5p过表达诱导的凋亡率（P＜0.01）;与Ct-si NC组相比,Ct-si MAP4K4显著促进Ct持续性感染细胞的凋亡（P＜0.01）,流式细胞术结果与Hoechst染色结果趋势一致;JC-1结果显示,与阴性组相比,miR-1224-5p mimic和si MAP4K4可引起线粒体膜电位（MMP）的降低（P＜0.01）,并导致细胞色素C的释放显著增加（P＜0.05）,而Ct持续性感染可减弱miR-1224-5p过表达对MMP以及细胞色素C释放的影响（P＜0.05）;Western blot结果显示,与阴性对照组相比,miR-1224-5p mimic和Ct-si MAP4K4组Bcl-2/Bax比值降低,cleaved caspase 3表达增加（P＜0.05）,与IFN-γ对照组相比,持续性感染组p/t-ERK水平升高（P＜0.05）,Ct-si ZEB1-AS1或Ct-si MAP4K4组显著降低了持续性感染组p/t-ERK的水平（P＜0.05）。7.IFA结果显示,转染LV10N-si NC或LV10N-si MAP4K4组细胞可观察到红色荧光的表达;q RT-PCR结果显示,与LV10N-si NC组比较,LV10N-si MAP4K4组MAP4K4表达显著下调（P＜0.05）。8.IFA结果显示,与对照组相比,si MAP4K4和PD98059（20μM）显著抑制Ct在He La细胞中的感染率（P＜0.05）;同时,si MAP4K4和PD98059均能显著抑制Cm在RAW 264.7细胞中的感染率（P＜0.01）;Mouse Cytokine Array芯片结果显示,与对照组相比,si MAP4K4处理后,G-CSF、IL-12、IL-6出现上调趋势,PD98059处理后,CTACK、CCL11、IL-2、IL-10、IL-17、TNF-α、THPO出现下调趋势,si MAP4K4+PD98059共处理后,CTACK、CCL11、IL-2、IL-10、IL-12、IL-17、KC、MIP-2、s TNFR1、TNF-α、THPO均出现下调趋势（P＜0.05）;GO和KEGG分析发现差异表达的细胞因子和趋化因子功能富集于炎症应答、T细胞增殖调控、JAK-STAT信号通路调控以及白细胞介导的免疫调节等等。9.慢病毒能成功侵染小鼠脾细胞;q RT-PCR结果显示,与对照组相比,Cm-LV10N-si MAP4K4组小鼠脾脏、肝脏、肾脏以及子宫MAP4K4表达均显著下调（P＜0.05）;IHC结果显示,与对照组相比,Cm-LV10N-si MAP4K4组小鼠子宫MAP4K4表达下调;在小鼠感染后的第6天,LV10N-si MAP4K4显著降低小鼠阴道的载菌量,在感染后第6天、第9天、第12天和第15天,PD98059显著降低小鼠阴道的载菌量;CCK-8检测结果显示,SPG组、Cm、Cm+si NC、Cm+si MAP4K4、Cm+DMSO、Cm+PD98059、Con A组小鼠脾细胞刺激指数分别为0.971±0.01、1.83±0.08、1.73±0.08、2.78±0.16、1.52±0.15、2.26±0.03、3.16±0.09,感染组均显著高于SPG对照组,且Cm+si MAP4K4组脾细胞刺激指数高于Cm+si NC组,Cm+PD98059组脾细胞刺激指数高于Cm+DMSO组（P＜0.01）;流式细胞术结果显示,在感染后的第7天,感染组CD4+、CD8+细胞比例高于SPG对照组,其中Cm+si MAP4K4组CD8+细胞比例显著高于Cm+si NC组（P＜0.05）;在感染后的第15天,SPG、Cm、Cm+si NC、Cm+si MAP4K4、Cm+DMSO、Cm+PD98059各组脾细胞中CD4+/CD8+的比值分别为1.64±0.20、1.84±0.04、1.80±0.07、2.26±0.01、1.96±0.16、1.92±0.03,感染组显著高于SPG对照组,Cm+si MAP4K4比值高于Cm+si NC组（P＜0.05）,相对SPG对照组,感染组脾细胞中CD8+/IFN-γ、CD8+/TNF-α、CD4+/IFN-γ和CD4+/TNF-α水平显著升高,而CD8+/IL-4和CD4+/IL-4水平无明显变化（P＜0.05）;与Cm+si NC对照组相比,Cm+si MAP4K4组脾细胞中CD8+/IFN-γ、CD8+/TNF-α和CD4+/TNF-α水平显著升高（P＜0.05）,而CD8+/IL-4和CD4+/IL-4水平无明显变化,Cm+DMSO与Cm+PD98059组比较,IFN-γ、TNF-α和IL-4水平均无显著差异。10.在感染后第15天,肉眼观察到Cm、Cm+si NC、Cm+si MAP4K4、Cm+DMSO组子宫角整体肿大,Cm+PD98059组子宫未见肿大;HE染色结果显示,Cm+si MAP4K4相较于Cm+si NC组出现比较严重的炎性细胞浸润,而Cm+PD98059与Cm+DMSO组相比,Cm+PD98059组只有少量炎性细胞;在感染后第60天,肉眼观察小鼠输卵管积水的发生率除Cm+si NC和Cm+si MAP4K4组为75%（n=4）外,其余感染组为100%,肉眼积水评分结果为0.00±0.00（SPG）、3.50±0.58（Cm）、3.00±2.16（Cm+si NC）、1.50±1.29（Cm+si MAP4K4）、3.75±1.71（Cm+DMSO）和1.25±0.50（Cm+PD98059）,PD98059能显著降低Cm所导致的输卵管积水评分值,而si MAP4K4无显著性差异;HE染色结果显示,各感染组比较SPG对照组均发生输卵管管腔扩张,并有以单核细胞为主的炎性细胞浸润渗出,Cm+si MAP4K4和Cm+PD98059组比较对照组小鼠输卵管扩张程度评分值显著降低,且Cm+PD98059组炎症细胞浸润评分值显著降低。结论:1.Ct通过上调lncRNA MIAT抑制线粒体凋亡途径和衣原体生长发育。2.Ct通过上调lncRNA ZEB1-AS1调控miR-1224-5p/MAP4K4分子轴,活化MAPK/ERK信号通路抵抗宿主细胞凋亡并影响衣原体感染率。3.Ct通过上调MAP4K4抑制T细胞免疫和IFN-γ的分泌,促进衣原体存活和小鼠生殖道慢性炎症性损伤。4.MAPK/ERK信号通路与小鼠生殖道衣原体的清除密切相关,并通过促进促炎因子的分泌,加重衣原体感染所致的输卵管水肿。